糖尿病聽力損害大鼠耳蝸組織糖基化終末產(chǎn)物受體表達(dá)及意義

高海濤，曲雁，張勛，穆俊晌，張璞，王欣，趙秀棉

(1河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，石家莊050000；2河北省平泉縣醫(yī)院)

糖尿病患者耳蝸微血管病變會引起細(xì)胞損傷，造成聽力損害[1～3]。研究顯示，氧化應(yīng)激、代謝異常、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)等參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[4,5]。糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)可以與AGEs特異性結(jié)合，影響細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，調(diào)控生長因子或細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[6]。但是，AGEs/RAGE在糖尿病聽力損害發(fā)生中的作用尚未明確。2016年2月～2017年1月我們進(jìn)行本研究，探討糖尿病聽力損害大鼠模型耳蝸組織RAGE表達(dá)及意義。

1　材料與方法

1.1材料Wistar雄性大鼠32只，11～12周齡，體質(zhì)量190～200 g，購自河北實驗動物中心[SCXK(冀)2013-1-003]；RNA提取試劑盒購自美國Promega公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒購自德國QIAGEN公司；RAGE一抗、生物素標(biāo)記的二抗購自美國Abcam公司；GAPDH一抗購自美國Santa Cruz公司；DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；LDL-c檢測試劑盒購自卡邁舒(上海)生物科技有限公司。

1.2模型制作及處理Wistar大鼠飼養(yǎng)溫度為21.5～23.5 ℃，自然采光，通風(fēng)良好，濕度為50%～60%。所有大鼠飼喂7天后禁食12 h。將大鼠隨機分為兩組，每組16只。模型組靜注含0.1% STZ的檸檬酸溶液(55 mg/kg)，對照組給予同等劑量的檸檬酸溶液。注射后第3天，鼠尾采血，血糖儀檢測血糖，模型組血糖均>16.7 mmol/L，即造模成功。造模后模型組每天給予生理鹽水灌胃，在20周內(nèi)保持空腹血糖>16.7 mmol/L。造模過程中模型組死亡2只，對照組隨機選取2只大鼠剔除，最終兩組大鼠均為14只。

1.3相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1腦干聽覺誘發(fā)電位(ABR)相關(guān)指標(biāo)飼養(yǎng)20周時檢測兩組ABR。具體方法：兩組均腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，在電屏蔽室中采用多功能ABR儀檢測ABR閾值，隔音室的本底噪聲為30 dB SPL。將銀制的針形電擊放在大鼠顱頂外耳道和正中線交匯部分的皮下位置，參考電極放在給聲側(cè)的耳垂，接地電極放在鼻尖。每個電極置于皮下約8 mm處，給聲耳機放在距離測定耳的外耳道15 mm處。用短聲刺激，掃描時間為20 ms，刺激頻率為20次/s，迭加512次，帶通濾波為190～2 000 Hz。按照10 dB依次遞減，從100 dB SPL開始，當(dāng)接近閾值后按照2 dB逐漸遞減。聽反應(yīng)閾定義為剛好能夠引起重復(fù)性較好的波Ⅲ最小的聲壓級。以70 dB SPL的刺激強度為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計波Ⅰ、波Ⅲ及波Ⅴ潛伏期，波Ⅰ～Ⅲ間期、波Ⅲ～Ⅴ間期、波Ⅰ～Ⅴ間期。

1.3.2血清LDL-c、HbA1c、AGEs水平兩組大鼠在飼養(yǎng)20周結(jié)束時斷頭處死，處死前14 h禁食，處死后迅速心臟采血。采用ELISA法檢測血清LDL-c，采用BIO-RAD-D10高效液相色譜法檢測血清HbA1c。采用熒光分光光度計檢測血清AGEs，激發(fā)波長為370 nm，發(fā)射波長為440 nm，以熒光強度表示AGEs水平。

1.3.3組織病理學(xué)改變采用HE染色。兩組大鼠斷頭處死后將兩側(cè)聽泡取出，將一側(cè)聽泡的聽骨和鼓膜挑出，在蝸尖鉆孔，將卵圓窗和圓窗開放，置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃過夜；PBS洗滌后置于10% EDTA脫鈣7天，每天更換1次脫鈣液；將耳蝸組織放入70%、80%、85%、95%、100%濃度梯度乙醇中脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，5 μm厚切片；將切片裱在預(yù)先用多聚賴氨酸處理的玻片上，65 ℃烘烤4 h；HE染色，光鏡下觀察耳蝸組織病理變化。

1.3.4耳蝸組織RAGE蛋白表達(dá)采用免疫組化法檢測。取1.3.3中常規(guī)石蠟包埋后切片的組織標(biāo)本，用3%過氧化氫孵育10 min，加入復(fù)合消化液在37 ℃孵育0.5 h，蒸餾水洗滌，加入山羊血清室溫封閉20 min，加入1∶300稀釋的RAGE抗體4 ℃過夜，PBS洗滌，加入生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育0.5 h，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察棕黃色顆粒為RAGE陽性。

1.3.5耳蝸組織RAGE mRNA表達(dá)采用RT-PCR法檢測。取1.3.3中兩組另一側(cè)聽泡各100 mg，采用TRIzol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增后檢測RAGE mRNA相對表達(dá)量。RAGE及GAPDH(內(nèi)參)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2　結(jié)果

2.1兩組ABR相關(guān)指標(biāo)比較模型組ABR閾值，波Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ潛伏期，波Ⅰ～Ⅲ間期、波Ⅲ～Ⅴ間期、波Ⅰ～Ⅴ間期閾值均高于對照組(P均<0.01)。見表1。

表1　兩組ABR相關(guān)指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.2兩組血清LDL-c、HbA1c、AGEs水平比較模型組血清LDL-c、HbA1c、AGEs水平均高于對照組(P均<0.01)。見表2。

表2　兩組血清LDL-c、HbA1c、AGEs水平比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.3兩組耳蝸組織病理學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示，對照組耳蝸組織中血管紋正常，模型組耳蝸中毛細(xì)血管管徑變小、管腔變細(xì)。

2.4兩組耳蝸組織RAGE蛋白表達(dá)比較模型組11只大鼠耳蝸組織表達(dá)RAGE，陽性率為78.57%；且RAGE主要在血管紋細(xì)胞胞質(zhì)中，在螺旋神經(jīng)節(jié)中也有RAGE表達(dá)。對照組1只大鼠耳蝸組織血管紋細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)RAGE，陽性率為7.14%。兩組RAGE表達(dá)陽性率比較P<0.05。

2.5兩組耳蝸組織RAGE mRNA表達(dá)比較模型組大鼠耳蝸組織RAGE mRNA相對表達(dá)量為1.82±0.13，對照組為1.00±0.08，兩組比較P<0.01。

3　討論

周圍神經(jīng)和血管病變是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的主要原因[7,8]。Kazmierczak等[9]研究顯示，糖尿病患者眩暈、聽力下降等內(nèi)耳疾病的發(fā)生率約為正常人的2倍。原因為長期高血糖狀態(tài)引起外周神經(jīng)損傷，導(dǎo)致內(nèi)耳細(xì)胞和神經(jīng)間突觸、顱神經(jīng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)生病變，引起聽神經(jīng)發(fā)生障礙[10]。王士禮等[11]研究表明，糖尿病大鼠模型的內(nèi)耳毛細(xì)血管基底膜異常。因耳蝸組織內(nèi)耳動脈相互之間沒有分支循環(huán)，微血管發(fā)生病變以后會引起其中一支動脈發(fā)生堵塞，影響血液循環(huán)，導(dǎo)致聽力障礙[12]。

在高糖狀態(tài)下，氧化應(yīng)激會損害蛋白質(zhì)、核酸等結(jié)構(gòu)，AGEs變成修飾蛋白，而修飾蛋白可以成為自身抗原，從而影響基因表達(dá)[13]。AGEs還可與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，趨化白細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，導(dǎo)致鄰近的細(xì)胞產(chǎn)生大量代替物質(zhì)，引起基質(zhì)異常增生。LDL-c糖基化會引起動脈粥樣硬化，糖尿病患者血液中可出現(xiàn)AGEs-LDL復(fù)合物，導(dǎo)致LDL-c的正常識別和降解發(fā)生延遲，引起血脂異常升高；而機體內(nèi)的AGEs-LDL被吞噬細(xì)胞吞噬后積聚在血管壁，又會進(jìn)一步加重血管病變[14]。本研究模型組血清AGEs、LDL-c、HbA1c水平均升高，說明AGEs參與糖尿病的發(fā)生過程。

腦干的ABR能夠間接反映腦干功能和蝸后功能，ABR又稱為腦干聽覺誘發(fā)電位(BAEP)。ABR波的來源分別為：波Ⅰ：反映耳蝸以及聽神經(jīng)顱外段電位水平，波Ⅲ：反映上橄欖核電活動水平，波Ⅴ：反映下丘腦電活動水平[15,16]。當(dāng)機體的聽覺系統(tǒng)受到炎癥、占位病變、缺血等影響時，耳蝸組織發(fā)生水腫、纖維脫髓鞘，導(dǎo)致電活動異常，使ABR波型異常，潛伏期或波間期延長，ABR異常發(fā)生的概率隨著病程的增加而增加。研究顯示，糖尿病患者波Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ潛伏期延長，而對于波Ⅰ～Ⅲ、波Ⅰ～Ⅴ、波Ⅲ～Ⅴ間期變化的報道結(jié)果不同，可能與耳蝸神經(jīng)通路的病變程度不同有關(guān)[17]。本研究模型組波Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ潛伏期均延長，而波Ⅰ～Ⅲ、波Ⅰ～Ⅴ、波Ⅲ～Ⅴ間期亦均延長，且ABR閾值增加；提示糖尿病大鼠存在聽力損害，聲波的中樞神經(jīng)傳遞時間延長。HE染色結(jié)果顯示，模型組耳蝸中毛細(xì)血管管徑變小，管腔變細(xì)，進(jìn)一步明確了糖尿病大鼠存在耳蝸血管病變。

AGEs的受體RAGE存在于多種細(xì)胞膜上，RAGE屬于免疫球蛋白超家族的成員之一，是一個跨膜受體，與AGEs形成的AGEs-RAGE系統(tǒng)參與糖尿病血管病變過程[18]。在正常的人體中AGEs和RAGE均呈現(xiàn)低表達(dá)的狀態(tài)，當(dāng)受到高糖等刺激后其表達(dá)水平迅速升高，打破組織內(nèi)的氧化平衡，引起炎癥因子、生長因子異常分泌，導(dǎo)致組織損傷[19,20]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠耳蝸組織中RAGE表達(dá)陽性率高于正常大鼠，且其mRNA水平高于正常大鼠，說明RAGE參與了糖尿病聽力損害的發(fā)生。

綜上所述，AGEs、RAGE表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)糖尿病大鼠聽力損害的發(fā)生。

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