膀胱癌組織某一特異性EST片段全長(zhǎng)擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

趙振理，胡少華，郝川，史舒，任來成

(1 海南省婦幼保健院，?？?70100；2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院)

膀胱癌的發(fā)生與基因突變及基因異常表達(dá)有關(guān)。為了從基因水平對(duì)膀胱癌進(jìn)行研究，臨床需要對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分離、克隆和序列分析[1，2]。本課題組前期應(yīng)用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)從膀胱癌組織中獲得一條類似表達(dá)細(xì)胞角蛋白20(CK20)基因的特異性表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)片段，該EST片段具有較大的特異性，并且變異程度高，但其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚[3]。2014～2016年，本研究對(duì)該EST片段進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料膀胱癌組織取自1例于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療的膀胱癌患者，患者為男性，65歲；術(shù)后病理證實(shí)為移行細(xì)胞癌，臨床分期為T3期，臨床分級(jí)為G2～G3級(jí)。主要試劑：DNA片段玻璃奶純化回收試劑盒(北京博大泰克生物公司)；cDNA RACE擴(kuò)增試劑盒(BD SMART RACE cDNA Amplification，KitClontech公司)。主要儀器：PCR擴(kuò)增儀(2400，美國(guó)PE公司)，DNA測(cè)序儀(ABI377，美國(guó)PE公司)，DEPC(美國(guó)Sigma公司)，電泳槽(東方儀器廠)，臺(tái)式離心機(jī)(北京市六一儀器廠)，紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.2膀胱癌組織變異EST片段的提取及全長(zhǎng)擴(kuò)增①總RNA提?。翰捎卯惲蚯杷犭乙徊椒ㄌ崛“螂装┙M織總RNA。取1 g膀胱癌新鮮組織進(jìn)行冰浴，剪碎膀胱癌組織后加入少許變性液，低溫研磨；依次加入2 mol/L的 NaAc(pH值為4.0)1.0 mL、水飽和酚10 mL、氯仿:異戊醇(49∶1)2 mL；將其冰浴15 min后在12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清液；再次加入相同量的變性液、NaAc、水飽和酚、氯仿:異戊醇進(jìn)行混勻，相同條件下離心15 min；提取上清液，加入等量異丙醇進(jìn)行混勻并沉淀2 h，離心后棄上清；75%冷乙醇進(jìn)行混勻，離心10 min；負(fù)壓晾干后加入適量無RNA酶進(jìn)行溶解，-20 ℃條件下保存。② mRNA定性定量分析：對(duì)提取的總RNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，并利用分光光度計(jì)檢測(cè)mRNA在260 nm和280 nm的光密度(OD)值。③引物設(shè)計(jì)：根據(jù)該特異性EST片段的序列設(shè)計(jì)5′和3′特異性引物及巢式引物，引物長(zhǎng)度27～28 bp。利用SMART (Switching Mechanism At 5′end of RNA Transcript)和RACE(Rapid Amplificationof cDNA Ends)技術(shù)克隆該特異性EST片段的全長(zhǎng)。④巢式PCR產(chǎn)物鑒定：采用瓊脂糖電泳法。利用玻璃奶快速純化回收試劑盒回收DNA片段；電泳分離待回收DNA片段，將需要的DNA片段從瓊脂糖凝膠上切下后放入1.5 mL Eppendorf管內(nèi)；向Eppendorf管內(nèi)加入適量溶膠液后在室溫條件下放置5 min；加入10 μL玻璃奶進(jìn)行混勻，12 000 r/min離心30 s，棄上清液；加入20 μL洗脫緩沖液混勻，水浴后進(jìn)行離心，回收上清備用。⑤回收DNA測(cè)序：采用GeneTool軟件合成RACE測(cè)序結(jié)果。

1.3EST片段的生物信息學(xué)分析①利用NCBI提供的開放閱讀框(ORF) Finder程序，將獲得的特異性EST片段通過RACE合成的DNA結(jié)果輸入ORF Finder程序?qū)υ捒?，搜索其讀碼框(網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。②利用NCBI提供的Forward e-PCR程序，將所獲得的EST片段通過RACE合成的DNA結(jié)果輸入上述程序?qū)υ捒?，獲得染色體的DNA定位Marker，將該DNA定位Marker連接到DNA定位圖譜，進(jìn)行染色體DNA定位，在NCBI提供的Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與DNA定位Marker對(duì)應(yīng)的基因定位(網(wǎng)址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/e-pcr/forward.cgi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)。③利用NCBI提供的Blastn程序，在對(duì)話框中輸入RACE合成的DNA結(jié)果并選擇human EST，搜索與之最為匹配的EST序列，從而進(jìn)一步確定該cDNA歸屬的UNGENE(網(wǎng)址http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)。④利用Primer5.0軟件，將ORF的DNA序列輸入對(duì)話框，點(diǎn)擊DNA→PRO按鈕，軟件將自動(dòng)生成氨基酸序列。將自動(dòng)生成的氨基酸序列輸入NCBI提供的Blastp對(duì)話框，點(diǎn)擊BLAST按鈕，獲得與之最為匹配的氨基酸序列，并結(jié)合NCBI提供的tblastn程序，分析其蛋白的具體歸屬情況(網(wǎng)址http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM=tblastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn)。⑤利用瑞士生物信息院提供的蛋白分析專家系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System)ExPASY-ProtParam Tool，分析ORF翻譯的多肽序列，可以獲得其蛋白性質(zhì)相關(guān)信息(網(wǎng)址http://web.expasy.org/protparam/)。⑥將ORF翻譯的多肽序列輸入Signal P 3.0 Serve軟件對(duì)話框，分析蛋白的信號(hào)肽、裂隙結(jié)構(gòu)及錨定結(jié)構(gòu)等信息(網(wǎng)址http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。⑦利用Sequin軟件編輯上述結(jié)果，上報(bào)NCBI GenBank，經(jīng)校對(duì)認(rèn)可后，獲得GenBank accession number(E-mail: gb-admin@ncbi.nlm.nih.gov)。

2　結(jié)果

2.1特異性EST片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果5′測(cè)序結(jié)果和3′測(cè)序結(jié)果整合后全長(zhǎng)1 839 bp，即GeneBank中基因號(hào)為KR780251序列，全長(zhǎng)序列見圖1。

2.2cDNA讀碼框NCBI提供的ORF Finder程序發(fā)現(xiàn)，該cDNA在17～19位有起始密碼子ATG，1 286～1 288位有終止密碼子TGA，其讀碼框見圖2。

2.3DNA定位MARKER結(jié)果NCBI提供的e-PCR程序進(jìn)行DNA定位結(jié)果顯示，其MARKER為RH12536，位于17號(hào)染色體410 327～414 666 bp處，與C17orf97基因處于同一位置，位于17p13.3。

圖1　特異性EST片段全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果

圖2　特異性EST片段cDNA讀碼框

2.4染色體DNA定位結(jié)果根據(jù)DNA定位Marker連接到DNA圖譜，在NCBI提供的Gene數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，其與C17orf97基因處于同一位置。

2.5核酸比對(duì)cDNA歸屬結(jié)果利用NCBI提供的blastn進(jìn)一步確定RACE合成cDNA歸屬，與C17orf97基因位置相同。

2.6開放閱讀框架翻譯多肽序列利用Primer5程序?qū)RF翻譯為多肽序列，結(jié)果見圖3。

圖3　開放閱讀框架翻譯多肽序列

2.7多肽序列分析結(jié)果利用NCBI提供的blastp、tblastn，ExPASY-ProtParam Tool進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白由423個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為46 413.3 bp，等電點(diǎn)為8.61。

2.8蛋白分析結(jié)果SignalP 3.0分析結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，該蛋白為跨膜蛋白和信號(hào)肽的可能性不大，裂隙結(jié)構(gòu)在31～32位氨基酸位置的可能性最大。

2.9NCBI GenBank校對(duì)結(jié)果該序列在GeneBank獲得基因號(hào)為KR780251，ORF翻譯的多肽序列獲得蛋白ID為AKO62675。

3　討論

近年來，從基因水平對(duì)膀胱癌進(jìn)行研究逐漸成為熱點(diǎn)[4～6]。SSH能夠克隆低豐度的差異表達(dá)基因，且敏感性及特異性均較高，被廣泛用于差異表達(dá)基因的分離、克隆和序列分析[7]。Adams等[8]于1991年提出EST技術(shù)，用于尋找并定位人類新基因。EST技術(shù)從提出到現(xiàn)在，已經(jīng)幫助人們發(fā)現(xiàn)了大量的新基因，充分證明該技術(shù)的有效性[9]。為了從基因水平對(duì)膀胱癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，本課題組前期利用SSH對(duì)膀胱癌組織與正常膀胱黏膜組織進(jìn)行對(duì)比分析，獲得上百條EST片段；其中絕大部分是已知片段，但有一條片段具有較大的特異性，其變異程度高，經(jīng)網(wǎng)上比對(duì)，發(fā)現(xiàn)為一條類似表達(dá)CK20基因的片段。CK20是Moll等[10]在1990年首次分離出的一種角蛋白，含有424個(gè)氨基酸，在胃腸道上皮細(xì)胞、默克爾細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞等均有表達(dá)，而正常尿路上皮細(xì)胞不表達(dá)，與膀胱癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11～14]。為了明確變異EST片段在膀胱癌中的作用，本研究通過RACE擴(kuò)增技術(shù)對(duì)此EST片段進(jìn)行擴(kuò)增得到cDNA全長(zhǎng)序列，分析發(fā)現(xiàn)讀碼框完整，為下一步的生物信息學(xué)研究提供了較好的基礎(chǔ)。

通過對(duì)ORF翻譯多肽序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列全長(zhǎng)有423個(gè)氨基酸，而CK20有424個(gè)氨基酸，因此該序列與CK20不同。通過NCBI提供的BLASTN及BLASTP等程序進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的多肽序列與Strausberg等[15]發(fā)現(xiàn)的序列具有高度相似性，他們向NCBI申請(qǐng)將其命名為C17orf97，但未進(jìn)一步對(duì)此段多肽序列進(jìn)行研究。Brower等[16]首先在小鼠中發(fā)現(xiàn)上述序列，并向NCBI的GenBank提交此序列獲得基因號(hào)LIAT1，后期研究發(fā)現(xiàn)在人體中也存在該序列。LIAT1基因位于端粒的近端區(qū)域，此區(qū)域易導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性，其可促進(jìn)人精胺?；D(zhuǎn)移酶1(ATE1)的精胺?；^程，以此促進(jìn)相關(guān)蛋白降解。該段多肽序列中具有一段重復(fù)性的氨基酸序列，并且在不同的生物中其重復(fù)次數(shù)不同，因此Brower等[16]提出此段氨基酸序列的重復(fù)次數(shù)可能與生物進(jìn)化有關(guān)。本研究檢索發(fā)現(xiàn)尚未有關(guān)于LIAT1(又稱為C17orf97)在膀胱癌中的表達(dá)情況的相關(guān)研究，因此利用sequin軟件向NCBI GenBank提交申請(qǐng)并獲得基因號(hào)KR780251和蛋白ID為AKO62675。

綜上所述，該膀胱癌組織特異性EST片段全長(zhǎng)序列KR780251有1 839 bp，含有完整的ORF，KR780251編碼的蛋白AKO62675可能是正常膀胱組織基因的突變體編碼所得，但相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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