廣泛期與局限期小細胞肺癌差異表達miRNAs的篩選及生物信息學分析

薛亞軍，耿濤，黃冰，羅波，魏育濤

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

小細胞肺癌(SCLC)具有高度侵襲性，早期即可通過血液循環(huán)及淋巴結轉移至多個臟器，其易發(fā)生轉移的確切機制目前仍不清楚。miRNAs是一組長度為20～22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因的3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)結合調控基因表達[1]。目前在人體中已發(fā)現(xiàn)1 880多個miRNAs，約30%的人類蛋白編碼基因受miRNAs調控[2]。異常表達的miRNAs與人類多種腫瘤的轉移密切相關[3]。研究發(fā)現(xiàn)，位于靶基因3′-UTR中的單核苷酸可調控miRNAs與靶基因的結合，進而調控SCLC的發(fā)生、發(fā)展[4]；miRNAs在血漿或血清中的穩(wěn)定性良好，能對抗RNA酶降解[5]，有望成為早期SCLC診斷、治療及患者預后判斷的理想非侵入性生物標志物?；蛐酒且环N快速有效檢測miRNAs表達譜的技術。2015年4月～2016年12月，我們利用基因芯片技術篩選廣泛期與局限期SCLC間差異表達miRNAs，現(xiàn)分析結果，探討SCLC轉移過程中整個基因組及信號通路的變化。

1　材料與方法

1.1基因表達數(shù)據(jù)在高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(GEO)檢索框中以“small cell lung cancer”和“metastasis”為檢索詞，獲得GSE67804芯片數(shù)據(jù)。GSE67804所用的實驗平臺為Illumina公司的Agilent-038166 cbc_human_miR18.0芯片。采用6例SCLC患者的血清樣本，其中3例為廣泛期SCLC(ED組)，3例為局限期SCLC(LD組)。登錄號GSM1656377～GSM1656379為ED組樣本，登錄號GSM1656380～GSM1656382為LD組樣本。

1.2數(shù)據(jù)過濾、標準化及差異miRNAs篩選將GEO中下載的數(shù)據(jù)集導入Qlucore Omics Explorer3.0軟件；對數(shù)據(jù)信息進行標準化處理(平均數(shù)為0，標準差為1)，兩組樣本間比較采用t檢驗，對數(shù)據(jù)信息進行有效過濾。篩選出差異miRNAs，差異miRNAs的篩選條件為P<0.05，差異倍數(shù) |Fold change|≥2。

1.3差異基因的GO富集分析和通路分析利用TargetScan、miRDB、miRTarBase對差異miRNAs進行綜合靶基因預測，取至少2個以上軟件預測得到的基因作為靶基因。將篩選出的差異基因輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home. jsp)進行GO分析及KEGG信號通路分析，通過Fisher Exact Test計算P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4差異基因的STRING蛋白相互作用分析將差異基因導入String10.0在線分析網(wǎng)站http://string-db.org/)，將最低互作分值設置成高度可信(high confidence: 0.7)，進行靶基因的蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析。

2　結果

2.1兩組血清中差異miRNAs篩選ED組與LD組共篩選出17個差異miRNAs(P<0.05，|Fold change|≥2)，預測出1 421個靶基因。

2.2差異miRNAs靶基因的GO分析ED組較LD組差異miRNAs所對應的靶基因共參與24項顯著性功能，包括RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控，DNA模板轉錄及信號傳導等生物學過程(BP)，蛋白結合、DNA結合、轉錄因子活性及序列特異性DNA結合等分子功能(MF)，核質、細胞質及高爾基體等細胞組件(CC)。見表1。

2.3差異miRNAs靶基因參與的KEGG富集分析ED組與LD組差異miRNAs所對應的靶基因共參與19條顯著性信號通路，包括惡性腫瘤通路、胞吞作用、Ras信號通路、膽堿代謝、Rap1信號通路、調節(jié)干細胞多能性信號通路、SCLC、FoxO信號通路、mRNA監(jiān)視通路、PI3K-Akt信號通路、cAMP信號通路以及ErbB信號通路等。見圖1。

圖1　差異表達miRNAs靶基因的KEGG富集分析

2.4靶基因編碼蛋白間的相互作用通過靶基因的GO和KEGG pathway分析，得到顯著性GO和顯著性信號通路及其所屬的靶基因，取顯著性GO的靶基因和顯著性信號通路的靶基因交集，將這些靶基因集合匯總后通過STRING10.0在線分析軟件(http://string-db.org/)構建蛋白互作網(wǎng)絡。蛋白互作網(wǎng)絡分析顯示，在差異miRNAs靶基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡中，靶基因信號傳導及轉錄激活因子(STAT3)、SMAD3、E2F1、基質金屬蛋白2(MMP2)、SP1、雄激素受體(AR)、胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)、核因子κB1(NFκB1)、蛋白激酶2(AKT2)編碼蛋白在網(wǎng)絡中具有核心地位。

3　討論

SCLC轉移是多基因參與并調控的復雜生物學過程，分子間相互作用的調節(jié)在SCLC轉移形成中的具體作用及作用機制尚未明確。因此，結合基因芯片表達數(shù)據(jù)的挖掘及生物信息學分析，從分子水平揭示SCLC轉移的本質，研究SCLC轉移相關基因，可為更好地理解SCLC轉移進展、惡化機制提供有益的向導性線索。研究證實，miRNAs可作為腫瘤的促進因子調控細胞增殖、侵襲、轉移和血管生成等[6]，并參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后等整個過程[7]。本研究利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件對芯片數(shù)據(jù)進行挖掘共篩選出17個差異miRNAs；差異miRNAs所預測靶基因的GO和KEGG富集分析結果中，GO富集結果提示這些miRNAs可能通過調控腫瘤細胞的轉錄、轉錄因子結合及激活、細胞連接以及細胞內受體信號通路等影響癌細胞的轉移。KEGG結果顯示，差異表達miRNAs的靶基因顯著富集于胞吞作用、Ras信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路以及局部黏附通路等腫瘤相關信號通路。研究表明，在胞吞通路中關鍵蛋白發(fā)生功能紊亂可能導致腫瘤的發(fā)生，如銜接蛋白Epsins在肺癌中高表達，可以促進腫瘤細胞的侵襲[8]。Ras信號通路與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移密切相關。McCubrey等[9]在結腸癌、卵巢癌、黑素瘤等腫瘤中發(fā)現(xiàn)了Ras突變。在Rap1信號通路中，Rap1b也可在多種腫瘤中表達上調，激活Rap1b，促進血管生成、內皮細胞遷移及增殖，與腫瘤轉移密切相關[10]。PI3K-AKT 通路可通過MMPs活化誘導腫瘤細胞的侵襲，增加細胞的轉移能力[11]。Akca 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT通路的活化可導致肺癌細胞的侵襲能力增強。局部黏附通路能夠影響細胞的增殖、黏附，與腫瘤的侵襲和轉移相關[13]。這些結果說明胞吞作用、Ras通路、Rap1通路、PI3K-Akt通路及局部黏附通路等信號通路異?？赡苁荢CLC轉移的重要環(huán)節(jié)。而這些通路彼此之間是否會互相影響，也值得深入研究。

表1　差異miRNAs靶基因的GO富集分析

注：E(代表指數(shù))表示將前面的數(shù)字乘以10的n次冪。例:2.33E-08=2.33×10-8=0.000 000 023 3。

STRING蛋白互作分析結果顯示，差異miRNAs主要調控STAT3、SMAD3、E2F1、MMP2、SP1、AR、IGF1R、NFKB1、AKT2等關鍵靶蛋白表達。STAT3與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關[14]，STAT3激活可促進SMAD3表達，增加肺癌細胞遷移和侵入[15]。在95%的SCLC組織中E2F1表達升高，參與細胞黏附、細胞遷移、血管生成、侵襲轉移，并在轉錄后激活SP1和NF-κB[16]，通過調控MMPs表達發(fā)揮促侵襲轉移作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs家族的MMP2對肺癌侵襲和淋巴結轉移有促進作用[18]；SP1可通過調控腫瘤相關基因E2F1、MMP2表達而影響腫瘤的生長和轉移[19]；胰島素樣生長因子(IGF)和胰島素樣生長因子受體(IGFR)在SCLC中均呈高表達[20]；AR在肺癌中的表達提示患者預后可能更差[21]；AKT2在促進腫瘤細胞轉移方面發(fā)揮重要功能[22]，并可通過促進IGF1R表達使胰腺癌細胞運動增加[23]。上述研究中的蛋白與我們通過STRING預測處于核心地位的靶蛋白相吻合，提示這些靶蛋白很可能是SCLC轉移相關調控途徑的關鍵蛋白。

綜上所述，本研究通過對SCLC轉移相關基因芯片數(shù)據(jù)GSE67804的挖掘，篩選出17個差異表達miRNAs，它們通過調控胞吞作用、Ras通路、Rap1通路、PI3K-AKT通路、局部黏附通路以及STAT3、SMAD3、E2F1、MMP2、SP1、AR、IGF1R、NFKB1和AKT2等蛋白表達在SCLC廣泛轉移的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。上述差異表達miRNAs為SCLC廣泛轉移的早期診斷和治療提供了可能的生物標志物，并且為研究SCLC廣泛轉移發(fā)生的分子機制遴選出重要的信號通路及關鍵蛋白。

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