骨髓增生異常綜合征患者骨髓間充質(zhì)干細胞成骨成脂分化潛能及SDF-1、PD-L1表達觀察

龐艷彬，范麗霞，化羅明，薛華，柳嘉，郭慧敏，羅建民，杜欣

(1河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北保定071000；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；3廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組腫瘤性疾病，其特點是造血功能衰竭并有向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險[1，2]。目前研究[3,4]表明，MDS患者造血干細胞、骨髓微環(huán)境和免疫功能均存在異常。出生后，造血干細胞主要存在于骨髓，其所在的局部微環(huán)境稱為造血干細胞龕[5]。間充質(zhì)干細胞(MSC)是構(gòu)成造血干細胞龕的關(guān)鍵成分，具有支持骨髓正常造血和維持骨髓免疫穩(wěn)定的重要作用[6]。敲除小鼠MSC中的sbds基因?qū)е麓傺滓蜃覵100A8/9分泌增加，最終導(dǎo)致造血細胞中DNA損傷，這可能是MDS疾病進展的潛在機制[4]?；|(zhì)細胞衍生因子1(SDF-1)不僅可誘導(dǎo)造血干細胞歸巢、降低細胞對化療藥物的敏感性，還具有維持免疫突觸穩(wěn)定的作用[7]。程序性細胞死亡因子配體1(PD-L1)是抑制性免疫分子，廣泛表達在抗原提呈細胞上，與T細胞上的配體結(jié)合后傳遞抑制信號，通過多種途徑抑制T細胞的增殖、活化和效應(yīng)功能[8]。本研究觀察了MDS患者骨髓MSC的多向分化潛能及SDF-1、PD-L1的表達變化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 新診斷且未經(jīng)治療的MDS患者30例(病例組)，男19例、女11例，年齡34～80歲、中位年齡57歲。根據(jù)2008年WHO中MDS的分類標(biāo)準(zhǔn)，難治性血細胞減少伴有多系病態(tài)造血(RCMD)10例，環(huán)形鐵粒幼細胞性難治性貧血(RARS)2例，難治性血細胞減少伴有原始細胞增多(RAEB)9例，慢性粒單核細胞白血病(CMML)3例，不能分類的MDS(MDS-U)4例，MDS繼發(fā)白血病2例。根據(jù)IPSS積分將病例組進一步分為低危亞組(IPSS積分判定為低危和中危-Ⅰ)18例和高危亞組(IPSS積分判定為中危-Ⅱ和高危)12例。選擇與病例組性別、年齡相匹配的非惡性血液病患者納入對照組，男9例、女11例，年齡32～73歲、中位年齡55歲。取兩組新鮮骨髓標(biāo)本用于后續(xù)實驗。

1.2 骨髓MSC的分離、培養(yǎng)及多向分化能力鑒定 將兩組新鮮骨髓標(biāo)本離心獲得骨髓單個核細胞，將其種植在25 cm2的培養(yǎng)瓶，放置在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72 h后更換培養(yǎng)基并去除非貼壁細胞。每周換液2次，當(dāng)細胞達到70%～80%融合度后，應(yīng)用0.25%胰酶消化、1∶3傳代，收獲第2～4代的MSC。參考文獻[8]方法檢測第3代MSC中的CD34、CD45、CD73、CD90、CD109、CD166進行免疫表型鑒定。對第2代的MSC分化能力進行鑒定。成骨細胞分化鑒定：將MSC以2×104/cm2的密度接種在6孔板中，在人MSC成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，14 d后細胞固定，茜素紅染色、照相，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，MSC產(chǎn)生的鈣結(jié)節(jié)通過茜素紅染色呈現(xiàn)為紅色結(jié)節(jié)。成脂細胞分化鑒定：將MSC細胞以2×104/cm2密度接種于6孔板中，在MSC成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d后細胞固定，油紅染色，照相，MSC在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下能夠分化產(chǎn)生脂肪滴，油紅染色顯示為紅色結(jié)節(jié)。

1.3 MSC中SDF-1、PD-L1基因檢測 收集第3代MSC，加入1 mL的TRIzol提取總RNA，取3 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進行PCR擴增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，并在81 ℃各設(shè)一次讀板檢測熒光。擴增完成后，再進行熔解曲線分析，以0.17 ℃/s變化速度從55 ℃到95 ℃每隔2 s記錄一次熒光值，可獲得熔解曲線。為了減少各實驗組間的差異，每一標(biāo)本均設(shè)3組平行孔。SDF-1上游引物序列為5′-GCGCCATGAACGCCAAGGTCGTG-3′，下游引物序列為5′-CAATGCACACTTGTCTGTTGTTG-3′；PD-L1上游引物序列為5′-GGTGCCGACTACAAGCGAAT-3′，下游引物序列為5′-TGACTGGATCCACAACCAAAATT-3′；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5′-ATGAGACACACCTAAGGACC-3′，下游引物序列為5′-TATGGAGAAGATTTGGCACC-3′。目的基因的相對數(shù)值以2-ΔΔCt表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組MSC的形態(tài)、表型及多向分化潛能 所有對照組來源的MSC均能在體外實現(xiàn)生長，而30例MDS中只有20例患者的MSC實現(xiàn)體外生長。雖然兩組MSC均表現(xiàn)出纖維梭性外觀，但病例組MSC體積較大，多呈現(xiàn)扁平狀外觀(圖1)。兩組MSC具有相似的免疫表型，均表達MSC標(biāo)記CD73、CD166、CD105和CD90(>95%)，不表達可檢測到水平的CD34、CD45(<2%)。茜素紅和油紅染色結(jié)果證實兩組MSC在體外適當(dāng)誘導(dǎo)分化條件下可以分別向成骨細胞和成脂細胞分化(圖2)，但病例組MSC的成骨細胞分化潛能弱于對照組MSC。

2.2 兩組MSC中SDF-1、PD-L1表達比較 病例組、對照組MSC中SDF-1的 Ct值分別為6.14±1.37、7.25±1.23，PD-L1的 Ct值分別為11.66±0.95、13.27±0.92，表示病例組MSC中SDF-1、PD-L1的表達水平均高于對照組(P均<0.05)。病例組中，低危亞組、高危亞組MSC中SDF-1的 Ct值分別為5.77±1.30、6.88±1.20，兩亞組相比，P>0.05；高危亞組、低危亞組MSC中PD-L1的 Ct值分別為11.15±0.99、12.23±0.64，說明高危亞組的MSC中PD-L1的表達水平高于低危亞組(P<0.05)。

圖1 兩組MSC的形態(tài)

注：上圖為成脂分化實驗結(jié)果；下圖為成骨分化實驗結(jié)果，病例組MSC分化產(chǎn)生的紅色結(jié)節(jié)明顯少于對照組。

圖2兩組MSC的分化能力鑒定結(jié)果

3 討論

MSC具有支持正常造血和維持骨髓免疫穩(wěn)定的作用，是構(gòu)成骨髓微環(huán)境的關(guān)鍵成分[7]。有學(xué)者[9]敲除小鼠MSC中編碼核酸內(nèi)切酶Ⅲ的Dicer1基因?qū)е鹿撬璩霈F(xiàn)MDS樣造血，此后MSC的變化在MDS疾病進展中的作用日益受到重視。但目前對MDS患者MSC的免疫調(diào)節(jié)功能知之甚少。因此，本研究對參與免疫調(diào)控的SDF-1、PD-L1表達情況進行了初步分析。

首先，本研究發(fā)現(xiàn)病例組來源的MSC與正常MSC具有相似的免疫表型和多向分化潛能，但與正常MSC相比，病例組MSC除細胞形態(tài)發(fā)生改變以外，成骨細胞分化潛能明顯下降，這與Geyh等[10]的結(jié)果類似。但也有研究認為MDS患者MSC的成骨細胞分化潛能并未下降[11]。造成這種差異的原因可能是后者只使用了茜素紅化學(xué)染色定性分析MSC成骨細胞分化特點，不能充分反映細胞分化潛能間的數(shù)量差異。MDS患者MSC成骨細胞分化潛能下降可能具有重要的意義。動物實驗證實，即使具有相似的形態(tài)和免疫表型，但是成骨分化潛能下降的MSC不能在小鼠腎被膜下經(jīng)歷軟骨內(nèi)成骨過渡階段后形成適合造血干細胞生存的骨髓微環(huán)境[12]。

本研究還發(fā)現(xiàn)MDS患者MSC中SDF-1和PD-L1表達明顯升高，與Roversi等[13]的研究結(jié)果相似。骨髓活檢結(jié)果顯示MDS患者的MSC中CXCL-12的密度明顯高于良性血細胞減少患者。MSC密度增高的MDS患者總生存期明顯下降，死亡風(fēng)險是低、中等MSC密度患者的3.4倍，進展為急性髓系白血病的風(fēng)險為低、中等MSC密度患者的2倍[14]，但相關(guān)機制并不明確。SDF-1具有趨化作用，參與造血細胞的遷移、活化、歸巢。此外，SDF-1與受體結(jié)合后通過激活細胞內(nèi)GTP酶的方式激活整合素，參與免疫突觸的形成，并維持抗原提呈細胞和T細胞黏附性接觸，維持免疫突觸的穩(wěn)定，為TCR信號持續(xù)發(fā)揮作用提供了前提條件[7]。PD-L1廣泛表達在抗原提呈細胞上[15]。PD-L1與T細胞上的同源受體PD-1結(jié)合后使PD-1胞質(zhì)內(nèi)ITIM和ITSM模序被酪氨酸激酶家族和SHP磷酸化，磷酸化后的ITIM和ITSM進一步招募磷酸化的酪氨酸殘基。SHP可進一步使PI3K/Akt或RAS/MEK/ERK信號通路失活，導(dǎo)致細胞周期停滯；使ZAP70和PKC-θ去磷酸化從而抑制T細胞活化；PD-L1與T細胞上的PD-1結(jié)合后，可使初始T細胞轉(zhuǎn)化為免疫抑制性的調(diào)節(jié)性T細胞[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，病例組MSC中SDF-1和PD-L1表達水平高于對照組，且與低危亞組相比，高危亞組MSC中PD-L1表達增高，提示SDF-1、PD-L1可能促進了MDS疾病進展。SDF-1通過趨化作用使進入骨髓的免疫細胞黏附在MSC周圍，與MSC上的其他免疫分子形成穩(wěn)定的免疫突觸，MSC通過細胞表面的PD-L1抑制T細胞的增殖、活化，或誘導(dǎo)活化的T細胞分化形成調(diào)節(jié)性T細胞，從而使MDS腫瘤細胞周圍不能產(chǎn)生足夠數(shù)量或具有抗腫瘤效應(yīng)的細胞毒性T細胞[16]。與Wang等[17]的研究結(jié)果相似，高危MDC患者的MSC更易形成免疫抑制性的微環(huán)境。因此，通過干預(yù)MDS患者MSC免疫抑制微環(huán)境對腫瘤細胞的保護作用可能是進一步提高MDS治療效果的一種新方式。

總之，本研究證明MDS來源的MSC成骨細胞分化潛能減弱，SDF-1和PD-L1表達增高，且高?；颊咦兓鼮槊黠@；SDF-1和PD-L1可能在MDS疾病進展過程中發(fā)揮了重要作用。

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