白藜蘆醇對人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3增殖、凋亡的影響及其機(jī)制

張萬生，趙榮，田豐雨，侯建成，趙行宇

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

還具有各廣譜抗腫瘤活性，其對白血病、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[5～7]，但其抗前列腺癌的作用鮮有報(bào)道。本研究觀察了不同濃度白藜蘆醇對人前列腺癌細(xì)胞系PC-3增殖、凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 PC-3細(xì)胞由吉林醫(yī)藥學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。白藜蘆醇購自美國Sigma公司，純度99%，購買的白藜蘆醇溶于二甲基亞砜(DMSO)中，4 ℃儲存。MTT、DMSO購于Sigma公司。兔抗人Bcl-2、Bax、cleave-Caspase-3、PARP和β-actin單克隆抗體及抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞分組與白藜蘆醇用法 將PC-3細(xì)胞分為對照組和實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組。實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組分別給予10、50、100、150 μmol/L的白藜蘆醇處理24 h；對照組不加入藥物。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測算 采用MTT法。將對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞以3×104/孔的終濃度接種到96孔板中。各組細(xì)胞加藥處理24 h后，向每個(gè)孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)。孵育4 h后，丟棄MTT培養(yǎng)基，將紫色甲臜晶體溶解于DMSO中。在570 nm處使用自動微孔板讀數(shù)器測定對照組和各實(shí)驗(yàn)組孔中的光密度值(OD值)。按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求均值。

1.4 細(xì)胞凋亡率測算 按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行操作。各組給藥24 h后收集細(xì)胞并用冰冷的PBS洗滌2次。隨后將細(xì)胞重懸于緩沖液中，并在Annexin V-FITC、PI中在室溫下避光染色15 min。借助流式細(xì)胞術(shù)測算細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白檢測 各組處理24 h后，搜集細(xì)胞并用冷PBS洗滌2次。將所得細(xì)胞用裂解緩沖液在冰上裂解10 min。4 ℃下以12 000 g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新鮮管中-70 ℃儲存。用BDA檢測試劑盒測定蛋白濃度。將50 μg蛋白質(zhì)樣品在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。在室溫下，用Tris緩沖鹽水中的5%非脂肪乳封閉膜2 h，然后加入P53、Cleave-Caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)(1∶5 000)及β-actin(1∶1 000)一抗，在Tris緩沖鹽水中于4 ℃過夜。洗滌后加入二抗在室溫下培養(yǎng)2 h。采用Image Pro Plus軟件和電化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)，分析化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，以目的蛋白條帶發(fā)光值與內(nèi)參條帶發(fā)光值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 白藜蘆醇處理24 h后對PC-3細(xì)胞形態(tài)具有顯著影響，主要表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少，圓形細(xì)胞和細(xì)胞脫離，表明細(xì)胞死亡(圖1)。對照組及實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組OD值分別為0.998±0.165、0.683±0.131、0.565±0.090、0.375±0.108、0.285±0.070，各組OD值依次遞減(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞增殖抑制率分別為31.42%±10.13%、42.31%±12.76%、61.76%±12.72%、70.96%±8.29%，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率依次遞增(P均<0.05)?？梢姲邹继J醇在處理24 h后對PC-3細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用，呈劑量依賴性，計(jì)算得IC50值為23.25 μmol/L。

圖1 各組細(xì)胞給藥24 h后形態(tài)

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 對照組及實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞凋亡率分別為3.35%±0.62%、5.47%±0.87%、7.64%±1.25%、9.56%±1.55%、14.64%±2.21%，各組細(xì)胞凋亡率依次遞增(P均<0.05)。

2.3 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞中P53、PARP(89 kD)相對表達(dá)量高于對照組，實(shí)驗(yàn)2、3、4組細(xì)胞中Cleave-Caspase-3相對表達(dá)量高于對照組，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞中P53、PARP(89 kD)、Cleave-Caspase-3相對表達(dá)量依次增高(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡過程，不論是在正常生長發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)改建中還是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都非常重要。現(xiàn)已證實(shí)，由凋亡產(chǎn)生的損傷作用也是惡性腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵特征之一[8]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是有最有效的化療策略[9,10]。細(xì)胞凋亡通常由內(nèi)源和外源兩種途徑來介導(dǎo)[11,12]。在內(nèi)源性途徑中，Bax蛋白家族激活，作用于線粒體膜，細(xì)胞色素C釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13～16]。抑癌基因P53的作用是增加Bax蛋白的表達(dá)從而啟動內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑[17]；通過Bcl蛋白家族導(dǎo)致Caspase通路激活，啟動細(xì)胞凋亡。PARP可以結(jié)合DNA斷端并修復(fù)DNA損傷，其也是Caspase作用的底物。Caspase激活后，PARP被剪切并產(chǎn)生PARP 89 kD片段，失去結(jié)合并修復(fù)損傷DNA的功能。剪切型PARP在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上調(diào)，表明細(xì)胞凋亡過程已經(jīng)啟動，同時(shí)細(xì)胞的自身修復(fù)機(jī)制被抑制。

現(xiàn)有研究證明，白藜蘆醇對白血病、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[18,19]。然而，鮮見白藜蘆醇誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的報(bào)道，其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制也尚未闡明。為明確白藜蘆醇的抗前列腺癌效應(yīng)及其可能的分子機(jī)制，我們首先觀察了白藜蘆醇對PC-3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，對照組及實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組OD值依次遞減，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞增殖抑制率依次遞增，表明白藜蘆醇在處理24 h后對PC-3細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用，以劑量依賴性方式抑制PC-3細(xì)胞增殖。由于腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)是抗癌作用的主要觀察指標(biāo)[20]，為明確PC-3細(xì)胞增殖率的降低是否歸因于細(xì)胞凋亡，我們又觀察了白藜蘆醇處理后細(xì)胞凋亡率變化，發(fā)現(xiàn)對照組及實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞凋亡率依次遞增，說明白藜蘆醇可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制PC-3細(xì)胞的增殖活力。

線粒體途徑和死亡受體途徑是化療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的兩個(gè)主要途徑[21]。在線粒體途徑中，抑癌基因P53起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞中P53、PARP(89 kD)相對表達(dá)量高于對照組，實(shí)驗(yàn)2、3、4組細(xì)胞中Cleave-Caspase-3相對表達(dá)量高于對照組，實(shí)驗(yàn)1、2、3、4組細(xì)胞中P53、PARP(89 kD)、Cleave-Caspase-3相對表達(dá)量依次增高，表明白藜蘆醇處理PC-3細(xì)胞后P53、Cleave-Caspase-3蛋白表達(dá)水平上調(diào)，并加強(qiáng)PARP的片段切割。我們推測Caspase-3在PC-3細(xì)胞凋亡期間被激活，并通過作用于其底物PARP來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，白藜蘆醇可抑制PC-3細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用呈劑量依賴性，凋亡誘導(dǎo)機(jī)制可能與P53表達(dá)上調(diào)、Caspase-3被激活、增加PARP的剪切有關(guān)。本研究結(jié)果為白藜蘆醇用于前列腺癌的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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