含有草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷的大鼠血清對人肝癌細胞增殖、凋亡影響及其機制

鄭峰，崔香丹，金雪峰，全吉淑，尹學(xué)哲

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2臨沂市人民醫(yī)院；3延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。多數(shù)肝癌發(fā)現(xiàn)時已屬于晚期，失去了手術(shù)的最佳時機，介入治療及化療的不良反應(yīng)較大，靶向治療費用較高，患者生活質(zhì)量改善仍不太理想。大量臨床研究表明，中醫(yī)藥治療肝癌能夠減輕臨床癥狀，延長生存期，提高生存質(zhì)量，并且毒性反應(yīng)較輕[1，2]。草蓯蓉為列當(dāng)科本草植物，因其具有補腎壯陽、滋補強身及延年益壽的功效，常被用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、腸燥便秘等疾病[3]。我們前期實驗表明，草蓯蓉的主要提取物草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷(IGBR)是草蓯蓉有效的藥理成分，具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化及抗腫瘤的作用[4～6]。草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷是復(fù)合物，不是單體成分，經(jīng)過前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)單獨加藥對癌細胞沒有殺傷作用。我們查閱相關(guān)文獻后，發(fā)現(xiàn)草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷經(jīng)過機體復(fù)雜代謝，血清中含有抗癌成分馬錢子苷等單體，從血清作為培養(yǎng)基具有抗癌作用。為此，本研究觀察了含IGBR大鼠血清對人肝癌SMMC-7721細胞形態(tài)、增殖、凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物及主要實驗材料 人肝癌細胞株SMMC-7721購自武漢博士德有限公司，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量150～180 g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。IGBR由延邊大學(xué)全吉淑教授惠贈。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國BD公司。Bcl-2、Bax多克隆抗體購自美國CST公司。直徑0.22 μm過濾器購自德國默克密理博公司。超速冷凍離心機購自美國Sigma公司。倒置顯微鏡購自美國Bio Rad公司。分光光度計購自北京拜西歐斯生物技術(shù)有限公司。流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 含IGBR大鼠血清(藥物血清)的制備 60只Wistar雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為生理鹽水組、低劑量IGBR組、中劑量IGBR組、高劑量IGBR組，每組15只。生理鹽水組給予生理鹽水0.1 mL/100 g灌胃，低、中、高劑量IGBR組分別給予125、250、500 mg/kg的IGBR灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃1個月后麻醉大鼠并心臟取血。全血靜置2 h，經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心20 min后，抽取上層血清，置于56 ℃恒溫水浴箱中水浴30 min用以滅活血清中補體成分，經(jīng)0.22 μm過濾器除菌，制備成的藥物血清分裝后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 SMMC-7721細胞分組及藥物血清用法 SMMC-7721細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁單層覆蓋后，用胰酶消化3 min，收集細胞后將細胞密度調(diào)整為1×104/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，加入無血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，改用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。之后將細胞隨機分為4組，分別為對照組和實驗1、2、3組，各組每孔分別加入“1.2”中獲得的濃度從低到高的藥物血清各20 μL。

1.4 SMMC-7721細胞形態(tài)觀察及增殖率測算 分別于加藥物血清24、48 h后收集各組細胞，棄掉上清液，PBS緩沖液沖洗2次。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，采集圖像；每孔加入MTT溶液10 μL，分光光度計450 nm波長處檢測各孔光密度(OD)值，同時設(shè)一不含細胞的空白調(diào)零組，僅加入同等濃度的MTT溶液及無藥物血清的培養(yǎng)液，實驗重復(fù)3次，計算細胞增殖率。

1.5 SMMC-7721細胞凋亡情況觀察及凋亡率測算 于加藥物血清48 h后收集各組細胞，棄掉上清液，PBS緩沖液沖洗2次，以AO溶液和EB溶液按照1∶1混合成工作液，分別加入工作液1 mL，必須充分覆蓋細胞，置于熒光顯微鏡下觀察SMMC-7721細胞的凋亡形態(tài)，采集圖像。各組給藥48 h后棄上清液，胰酶消化后收集細胞，PBS緩沖液沖洗2次，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度，使每0.1 mL含有(1～5)×105個細胞，400 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入Annexin V-FITC、PI各10 μL，混勻后室溫避光10 min，流式細胞儀測算細胞凋亡率。

1.6 SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax蛋白檢測 將各組細胞以3×105/孔接種于6孔板中，每孔2 mL。待細胞貼壁后給予不同濃度的藥物血清處理48 h，用含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解30 min，震蕩30 s。經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心20 min后，BCA法測定蛋白濃度，100 ℃變性10 min。在15%的SDS-PAGE分離膠、5%濃縮膠電泳2 h，轉(zhuǎn)膜、封閉1 h，Bcl-2、Bax抗體置于4 ℃冰箱中孵育過夜，再經(jīng)二抗常溫下孵育1.5 h，顯影。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組SMMC-7721細胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察，實驗1、2、3組給藥48 h后，細胞發(fā)生變性、壞死，數(shù)量減少，細胞體積增大，細胞排列稀疏，隨著藥物血清濃度的增加，細胞壞死程度也加重。見圖1。

圖1 各組給藥24、48 h后SMMC-7721細胞形態(tài)

2.2 各組SMMC-7721細胞增殖情況比較 給藥24、48 h后實驗1、2、3組OD值和細胞增殖率均低于對照組，且實驗3組OD值和細胞增殖率低于實驗1組(P均<0.05)。實驗1、2、3組給藥48 h后OD值和細胞增殖率低于同組給藥后24 h(P均<0.05)。詳見表1。

表1 給藥后不同時間各組SMMC-7721細胞OD值與增殖率比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與實驗1組比較，#P<0.05。

2.3 各組SMMC-7721細胞凋亡情況及凋亡率比較 給藥48 h后，實驗1、2、3組細胞發(fā)生凋亡，細胞核染色為橘紅色并呈固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu)，細胞由圓形變?yōu)樗笮?圖2)。給藥48 h后實驗1、2、3組和對照組凋亡率分別為29.68%±1.17%、31.97%±3.36%、35.45%±3.96%、0.08%±0.03%，實驗1、2、3組細胞凋亡率均高于對照組(P均<0.05)。

2.4 各組SMMC-7721細胞中Bcl-2、Bax蛋白表達比較 給藥48 h后實驗1、2、3組和對照組細胞中Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.93±0.02、0.68±0.04、0.63±0.05、0.97±0.01，Bax蛋白相對表達量分別為0.28±0.01、0.33±0.09、0.35±0.05、0.25±0.04。與對照組相比，實驗1、2、3組Bcl-2蛋白表達量降低，Bax蛋白表達量增高(P均<0.05)；與實驗1組相比，實驗3組Bcl-2蛋白表達量降低，Bax蛋白表達量增高(P均<0.05)。

圖2 各組SMMC-7721細胞凋亡形態(tài)

3 討論

在腫瘤相關(guān)性死亡中肝癌僅次于肺癌和胃癌，居于第3位[7]。肝癌具有起病隱匿、進展快、惡性程度高的特點，目前沒有有效的治愈手段，患者預(yù)后較差。中醫(yī)藥療法對改善術(shù)后或放化療后肝癌患者的生活質(zhì)量有積極意義，尤其對于晚期肝癌患者，中醫(yī)藥療法能盡可能地讓患者在治療中受益。研究證實，IGBR有增強機體免疫力、保護肝臟、誘導(dǎo)肝臟清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和抗腫瘤等作用等，具有廣泛的藥理活性[8，9]。

細胞凋亡是程序性死亡過程，調(diào)控機體發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[10，11]。大量研究結(jié)果表明，凋亡基因在腫瘤細胞和實體腫瘤中均表達異常。細胞凋亡與細胞增殖之間的平衡狀態(tài)被打破，導(dǎo)致腫瘤不受控制的生長，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[12，13]。正常的凋亡減弱，才使得肝癌的生長能夠躲避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，加速細胞增生。大量研究數(shù)據(jù)表明，中草藥治療肝癌有不同程度地促進肝癌細胞凋亡的效果[14]。本研究結(jié)果顯示，實驗1、2、3組給藥48 h后，細胞發(fā)生變性、壞死。給藥24、48 h后實驗1、2、3組OD值和細胞增殖率均低于對照組，且實驗3組低于實驗1組。實驗1、2、3組給藥48 h后OD值和細胞增殖率低于同組給藥后24 h。給藥48 h后，實驗1、2、3組細胞呈凋亡形態(tài)；實驗1、2、3組細胞凋亡率均高于對照組。上述結(jié)果表明，IGBR有抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡的作用，且藥物濃度越高，作用越明顯。

凋亡相關(guān)蛋白(如Bcl-2、Bax)表達調(diào)節(jié)在細胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。正常情況下，凋亡相關(guān)蛋白表達處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)；當(dāng)細胞惡變時，凋亡蛋白表達失衡，誘導(dǎo)細胞凋亡抑制，細胞惡性增殖。Bcl-2作為原癌基因，可通過調(diào)控凋亡信號的表達來發(fā)揮抑制凋亡作用，其與細胞異常增殖有關(guān)，與肝癌的發(fā)生緊密相關(guān)[15，16]。抑癌基因Bax的作用與Bcl-2相反，能夠與Bcl-2形成異二聚體或同二聚體，誘導(dǎo)細胞凋亡，Bcl-2/Bax值也是決定細胞凋亡抑制作用強弱的關(guān)鍵[17]。當(dāng)Bcl-2高表達時，Bcl-2/Bax比例升高，抑制凋亡能力增強，促使腫瘤細胞的增殖；反之則抑制了Bcl-2的抗凋亡作用，加速細胞凋亡[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，半枝蓮提取物能夠誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡，用藥組肝癌細胞中Bcl-2表達減弱；山豆根提取物也可以使肝癌細胞Hep3B加速凋亡，可顯著增強Bax表達并抑制Bcl-2表達。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗1、2、3組Bcl-2蛋白表達量降低，Bax蛋白表達量增高；與實驗1組相比，實驗3組Bcl-2蛋白表達量降低，Bax蛋白表達量增高。這表明IGBR藥物血清可下調(diào)肝癌細胞中Bcl-2蛋白表達，上調(diào)Bax蛋白表達，這可能是IGBR抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡的機制。

綜上所述，含IGBR的大鼠血清可抑制SMMC-7721細胞增殖，并促進細胞凋亡，其機制可能與Bcl-2蛋白表達下調(diào)、Bax蛋白表達增高有關(guān)。本研究結(jié)果為今后草蓯蓉的抗腫瘤應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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