魚腥草水提液及其主要成分體外對71型腸道病毒的抑制作用觀察

張慧鋒，郭淑英，馬瑩慧，莊艷，于歡

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013；2吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；3齊魯醫(yī)藥學(xué)院)

手足口病是近年來嚴(yán)重影響嬰幼兒健康的一種傳染病，該病是由多種腸道病毒引發(fā)的嬰幼兒急性傳染病[1]，其中最為常見的病原體是腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CA16)[2]。EV71感染易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)損害[3]，常引起重癥甚至導(dǎo)致死亡[4]，因此許多研究者開展抗EV71感染研究[5～8]，以期實(shí)現(xiàn)對EV71感染所致手足口病的預(yù)防和治療，降低手足口病危重癥的發(fā)生率。傳統(tǒng)中草藥具有價(jià)格低廉、廣譜抗病毒等許多優(yōu)點(diǎn)[9]，其中很多中藥單體已被發(fā)現(xiàn)具有良好的抗EV71作用[10～12]，但中草藥口感較差，且部分具有腎毒性，在5歲以下患兒的預(yù)防和治療應(yīng)用中受到巨大限制。魚腥草為三白草科植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，具有清熱解毒等功能[13]?，F(xiàn)有研究[14～17]表明魚腥草對一些病毒具有抑制作用，且其為藥食兩用植物，嬰幼兒服用毒性作用小。為此，本研究觀察了魚腥草水提液及其主要成分綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素體外抗EV71的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞及主要實(shí)驗(yàn)材料 EV71采集于哈爾濱市兒童醫(yī)院，經(jīng)real-time PCR檢測為EV71陽性的樣本開展病毒分離，經(jīng)real-time PCR檢測確認(rèn)。RD細(xì)胞來源于人橫紋肌肉瘤細(xì)胞，由吉林大學(xué)饋贈，本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，最大代數(shù)為21代。魚腥草采購于吉林大藥房(太極集團(tuán)四川錦陽制藥有限公司，批號Z51020213)，經(jīng)鑒定為三白草科植物蕺菜的干燥地上部分。綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和槲皮素購自上海綠源生物有限公司(批號分別為R2015032、T2015141、W2015083、S2015168)，純度經(jīng)黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)所中藥室測定分別為99.68%、98.59%、98.36%和99.15%。主要試劑包括核酸提取試劑盒(QIAGEN 74104)、MEM(GIBCO 4500-034)、胎牛血清(Hyclone sr30087.02)、EDTA-胰酶(GIBCO 25200)、PBS(GIBCO 10010)、二甲基亞砜(Sigma D5879)、MTT(Amresco 0793)、手足口real-time PCR檢測試劑盒(江蘇碩世生物科技有限公司)。主要儀器包括核酸提取儀(德國QIAGEN公司QIAcube)、熒光定量PCR儀(美國 ABI 7500)、CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO MCO-15A)、倒置顯微鏡(日本Nikon TE2000-5)。

1.2 藥液配置及其細(xì)胞毒性檢測 ①病毒增殖和感染性的測定：按參考文獻(xiàn)[18]開展實(shí)驗(yàn)并測定病毒的TCID50=1.52×10-5/0.1 mL。②藥液配置：魚腥草藥液采用索氏提取器沸水浴中進(jìn)行恒溫浸提2 h，減壓抽濾，濾液過0.2 μm濾膜，定容至250 mL，則所得溶液當(dāng)量為50 mg/mL生藥，4 ℃保存?zhèn)溆茫唤鸾z桃苷藥液和綠原酸藥液以兩藥各20 mg分別加入到0.2 mL的DMSO和4.8 mL的5%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液組成的稀釋液中，藥液濃度為4 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?；槲皮素藥液和蘆丁藥液以兩藥各100 mg，加入到0.25 mL的DMSO和4.75 mL的5 %胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液組成的稀釋液中，藥液濃度為20 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。③藥液?xì)胞毒性檢測：將配置好的上述藥液用細(xì)胞培養(yǎng)液對倍稀釋5個稀釋度，接種于準(zhǔn)備好的RD細(xì)胞上，每個稀釋度設(shè)4孔，同時設(shè)不加藥液的正常細(xì)胞為對照，每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)7 d觀察藥物毒性，細(xì)胞出現(xiàn)病變者判為存在毒性。結(jié)果顯示各種藥液實(shí)驗(yàn)濃度對RD細(xì)胞均無細(xì)胞毒性作用，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 魚腥草水提液及其主要成分抗EV71作用觀察 將RD細(xì)胞分為魚腥草組、金絲桃苷組、槲皮素組、蘆丁組、綠原酸組、對照組。魚腥草組分別給予5 000、2 500、1 250、625、313 mg/L的魚腥草水提液；槲皮素組加入槲皮素藥液，蘆丁組加入蘆丁藥液，藥液濃度分別為10.00、5.00、2.50、1.25、0.63 mg/mL；金絲桃苷組加入金絲桃苷藥液，綠原酸組加入綠原酸藥液，藥液濃度分別為4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 mg/mL；對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液。

表1 魚腥草水提液及其主要成分對EV71的復(fù)制抑制作用、生長阻滯作用、抗吸附作用、滅活作用結(jié)果

1.3.1 病毒復(fù)制抑制作用觀察 取100 TCID50的EV71病毒液感染形成單層的RD細(xì)胞，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h后棄病毒液，用PBS洗單層細(xì)胞，將感染EV71的RD細(xì)胞分為6個組，各組給藥方法參考“1.3”，給藥后培養(yǎng)1～3 d，觀察細(xì)胞病變(CPE)。采用MTT法測算病毒復(fù)制抑制率[19]。以藥品濃度為橫坐標(biāo)，病毒復(fù)制抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50%抑制率對應(yīng)的藥液濃度即為IC50。

1.3.2 病毒生長阻滯作用觀察 將RD單層細(xì)胞分為6個組，分組及給藥方法參考“1.3”，培養(yǎng)3 d后棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次后加100 TCID50的EV71病毒液100 μL接種，37 ℃孵育1 h，用PBS清洗以去除未吸附的病毒，加入含0.5%胎牛血清的細(xì)胞維持液，培養(yǎng)1～3 d，逐日觀察CPE。生長阻滯率=[(A490測試孔-A病毒對照)/(A490細(xì)胞對照-A490病毒對照)]×100%。

1.3.3 抗病毒吸附作用觀察 將RD單層細(xì)胞分為6個組，根據(jù)“1.3”方法分別將不同藥物濃度培養(yǎng)液分別接入已長滿單層細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h后棄藥液，接入100 TCID50的EV71病毒液100 μL，37 ℃孵育2 h。用PBS洗單層細(xì)胞，去除未吸附的病毒和中藥成分，加入含0.5 %胎牛血清的細(xì)胞維持液，培養(yǎng)1～3 d，觀察CPE。吸附抑制率=[(A490測試孔-A病毒對照)/(A490細(xì)胞對照-A490病毒對照)]×100%。

1.3.4 滅活病毒作用觀察 取100 TCID50的EV71病毒液與不同藥物濃度培養(yǎng)液等體積混合，37 ℃作用90 min，然后4 ℃ 13 000 r/min離心5 min，去除中藥成分，沉淀用PBS洗滌后再4 ℃ 13 000 r/min離心10 min。病毒沉淀以DMEM培養(yǎng)液重懸，接種至單層RD細(xì)胞上，培養(yǎng)1～3 d，觀察CPE。滅活率=[(A490測試孔-A病毒對照)/(A490細(xì)胞對照-A490病毒對照)]×100%。

1.3.5 抗病毒穿入作用觀察 將單層的RD細(xì)胞接種100 TCID50的EV71病毒液100 μL，4 ℃下吸附1 h，用PBS洗單層細(xì)胞，去除未吸附的病毒。將吸附病毒的細(xì)胞分為6個組，各組按“1.3”方法加入不同濃度藥液37 ℃培養(yǎng)15、30、60 min，加入蛋白酶K反應(yīng)20 min，用1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)終止反應(yīng)，用PBS洗單層細(xì)胞2次，加入含0.5 %胎牛血清的細(xì)胞維持液，培養(yǎng)1～3 d，觀察CPE。穿入抑制率=[(A490測試孔-A病毒對照)/(A490細(xì)胞對照-A490病毒對照)]×100%。

2 結(jié)果

魚腥草水提液及主要成分綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素體對EV71的抗病毒作用結(jié)果見表1、2。由表1可知，魚腥草組、槲皮素組病毒復(fù)制抑制率高于其余四組，且藥物作用濃度越高，抑制作用越強(qiáng)(P均<0.05)；金絲桃苷組和蘆丁組病毒生長阻滯抑制率高于其余四組(P均<0.05)；金絲桃苷組、魚腥草組病毒吸附抑制率高于其余四組(P均<0.05)。魚腥草具有一定的病毒復(fù)制抑制作用和較弱的抗病毒吸附作用，IC50為3.22 g/L。金絲桃苷具有較弱的病毒生長阻滯作用和抗病毒吸附作用。槲皮素具有一定的病毒復(fù)制抑制作用，IC50為0.403 mg/mL。蘆丁具有較弱的病毒生長阻滯作用。魚腥草水提液及其主要成分均沒有滅活病毒的作用。

藥物作用15、30、60 min時各組CPE均為++++。由表2可以看出，各組在作用15、30 min時均未表現(xiàn)出對病毒穿入的抑制作用。在作用60 min時，魚腥草組、槲皮素組、蘆丁組、綠原酸組病毒穿入抑制率高于金絲桃苷組和對照組(P均<0.05)。魚腥草、槲皮素、蘆丁、綠原酸對EV71均有不同程度的穿入抑制作用。魚腥草對EV71穿入的抑制作用受濃度變化影響不明顯；槲皮素和蘆丁的作用隨藥物濃度降低而減弱；綠原酸的作用隨著濃度降低而增強(qiáng)。

表2 魚腥草水提液及其主要成分抗EV71病毒穿入作用結(jié)果

3 討論

手足口病為嬰幼兒傳染病，危重癥患者多為EV71型病毒感染。本研究期望在藥食兩種植物魚腥草中，找到對EV71有抑制作用的成分，在EV71感染所致手足口病的預(yù)防和治療中得以應(yīng)用。

通過研究發(fā)現(xiàn)，魚腥草具有抑制EV71病毒復(fù)制的作用，金絲桃苷、蘆丁、綠原酸沒有表現(xiàn)出這種作用，而槲皮素卻表現(xiàn)出這種作用。槲皮素為非水溶性物質(zhì)，因此可能是其他物質(zhì)在魚腥草水提液中起作用或槲皮素轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)類似產(chǎn)物起作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道魚腥草中槲皮素含量為2.11～4.65 mg/g[20，21]。如果是槲皮素結(jié)構(gòu)類似轉(zhuǎn)化產(chǎn)物起作用，根據(jù)槲皮素含量推算，魚腥草的IC50應(yīng)為87～191 g/L，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中魚腥草IC50為3.22 g/L，值較小，因此推斷是魚腥草水提液中其他物質(zhì)具有抑制EV71復(fù)制的作用，或槲皮素轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)類似產(chǎn)物作用增強(qiáng)。

魚腥草沒有顯現(xiàn)出對EV71病毒生長的阻滯作用，而金絲桃苷和蘆丁有較弱的生長阻滯作用。我們考慮魚腥草組結(jié)果出現(xiàn)的原因可能與用量有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，魚腥草中金絲桃苷含量為1.5～5.7 mg/g[21，22]，實(shí)驗(yàn)用魚腥草組最大金絲桃苷含量為0.007 5～0.028 5 mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于金絲桃苷組最低濃度0.25 mg/mL，因此可能是魚腥草組中金絲桃苷含量比較低，所以魚腥草組未能表現(xiàn)出對EV71的生長阻滯作用。同時，文獻(xiàn)報(bào)道魚腥草中蘆丁的含量為1.44～9.31 mg/g[23～25]，實(shí)驗(yàn)用魚腥草組最大蘆丁含量為0.007 2～0.046 5 mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于蘆丁組最低濃度1.25 mg/mL，同樣可能因?yàn)轸~腥草組中蘆丁含量比較低，導(dǎo)致魚腥草組出現(xiàn)陰性結(jié)果。因此可以推斷金絲桃苷和蘆丁具有對EV71的生長阻滯作用。

本研究結(jié)果顯示，魚腥草具有抗EV71吸附作用，金絲桃苷組同樣具有較弱的抗病毒吸附作用，而其他組別均無此作用；且金絲桃苷組的抗病毒吸附作用效果強(qiáng)于魚腥草組，推測作用差異與用量有關(guān)。

在本研究中，魚腥草水提液及其主要成分均未表現(xiàn)出滅活EV71的作用，說明魚腥草不具有滅活EV71的作用。作用60 min時魚腥草組表現(xiàn)出較弱的抗EV71穿入作用，同時槲皮素組、蘆丁組、綠原酸組也有抗EV71穿入作用；槲皮素組和蘆丁組的作用隨濃度降低而減弱，但綠原酸組該作用隨著濃度降低而增強(qiáng)，魚腥草組的作用隨濃度變化不明顯，可能是槲皮素、蘆丁、綠原酸等多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果。各組藥物作用15、30 min時均未表現(xiàn)出抗EV71穿入作用，說明該作用的發(fā)揮需要一定時間。

總之，上述研究結(jié)果為魚腥草水提液及其有效成分抗EV71的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。然而，中草藥的功效可能是多種成分共同作用的結(jié)果，同時由于藥物含量不同，因此整體功效與單一組分存在差異。我們認(rèn)為，魚腥草的抗病毒作用可能是通過多成分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制共同作用的結(jié)果，應(yīng)根據(jù)不同的目的開展更加深入的研究，以獲得更好功效的成分配比。

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