急性心肌梗死血漿標志代謝物及相關(guān)代謝通路的篩選

許文軒，李彤，張磊，連爍，稂與恒，胡曉旻，高文卿，寧萌

(1天津醫(yī)科大學三中心臨床學院，天津300000；2天津市第三中心醫(yī)院；3天津市人工細胞重點實驗室，衛(wèi)生部人工細胞工程技術(shù)研究中心)

急性心肌梗死(AMI)是一種常見的心血管急癥，發(fā)病率呈逐漸升高趨勢[1]，早期發(fā)現(xiàn)和治療對改善AMI患者預后、降低病死率至關(guān)重要[2]。經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術(shù)為經(jīng)心導管技術(shù)疏通狹窄甚至閉塞的冠狀動脈從而改善心肌灌注的治療方法。但患者在經(jīng)PCI治療后，仍有部分指標改變不明顯。同時，心肌梗死后并發(fā)癥也嚴重威脅著患者的生命。代謝組學能夠在特定的環(huán)境和時間條件下，定量檢測生物體內(nèi)代謝物水平并分析其變化趨勢。本研究借助代謝組學方法，對PCI治療的AMI患者血漿代謝輪廓進行分析，篩選與AMI疾病過程高度相關(guān)的特征代謝物，以便進一步認識AMI的發(fā)生發(fā)展機制，探討特征代謝物的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年12月～2016年7月于天津市第三中心醫(yī)院住院并施行PCI術(shù)的AMI患者。所有入選患者必須至少符合以下3條標準中的2條：①缺血性胸痛病史；②心電圖動態(tài)演變；③AMI相關(guān)血清心肌標志物動態(tài)改變。排除心絞痛、主動脈夾層、急性心包炎、急性肺動脈栓塞、心肌炎及心肌病等；排除其他非冠狀動脈粥樣硬化造成的AMI；排除合并糖尿病、脂肪肝、肝硬化等對代謝造成較大影響的疾病及其他肝腎疾病者。本研究共選入AMI患者25例，男13例、女12例，年齡(65±15)歲，設(shè)為病例組。分別于PCI術(shù)前和術(shù)后1 d采集患者的血液標本。選擇在天津市第三中心醫(yī)院體檢中心體檢的健康志愿者26例納入對照組，其中男14例、女12例，年齡(67±13)歲。兩組一般資料比較見表1。兩組血液標本采集后經(jīng)2 500 g離心，取血漿分裝，并于-80 ℃保存。本研究經(jīng)天津市第三中心醫(yī)院倫理委員會批準，所有血液標本的采集和臨床資料收集均獲得受檢者本人知情同意。

表1 病例組與對照組血漿TG、CHO、LDL、HDL、Hs-CRP、BNP CK CK-MB水平比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與同組術(shù)后相比，#P<0.05。

1.2 血漿樣本處理及總離子色譜、質(zhì)譜分析 取兩組解凍后的血漿標本200 μL，與600 μL甲醇溶液混合，于4 ℃靜置10 min。然后于4 ℃、10 000 g下離心30 min，提取上清液，經(jīng)真空離心蒸干得到干粉。然后以200 μL的5%甲酸乙腈溶液重溶，經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾后即得到待測樣品。采用基于超高效液相色譜與超高分辨生物質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)平臺進行血漿總離子色譜、質(zhì)譜分析。參照張立等[3]方法，進入Accela超高效液相色譜系統(tǒng)分析。采用二元溶劑梯度洗脫方式。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈混合溶液。色譜洗脫過程15 min，進液量10 μL，流動相流速為200 μL/min，自動進樣器溫度為4 ℃，柱溫20 ℃。起始梯度為5%流動相B，持續(xù)2.5 min，至8.5 min線性增至95%，維持3 min后降回5%，維持2.5 min以平衡色譜柱。質(zhì)譜系統(tǒng)為LTQ Orbitrap XL系統(tǒng)。選取正離子掃描模式。離子源電壓4.5 kV、錐孔電壓150 V、毛細管電壓30 V、去溶劑化溫度275 ℃、鞘氣流速30 arb(99.999%氮氣)、輔氣流速5 arb(99.999%氮氣)。數(shù)據(jù)采集貫穿色譜洗脫過程，采集范圍為質(zhì)核比(m/z)50～1 000、質(zhì)譜分辨率為100 000(FWHM全峰高半峰寬分辨率)。二級質(zhì)譜檢測采用碰撞誘導解離模式(CID)，能量設(shè)定為35(標準化碰撞能量)，碰撞氣體為99.999%高純氦氣。

1.3 血漿代謝輪廓分析 將由UPLC-MS平臺得到的數(shù)據(jù)導入MZmine2.0系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)前處理[4]。規(guī)則為提取離子色譜峰強度信噪比S/N>30、保留時間(RT)偏移不超過±0.1 min、m/z偏差不超過±0.02。按照如上規(guī)則對離子色譜峰進行識別、匹配及歸一化處理。將得到的數(shù)據(jù)導入SIMCA-P+12.0.1.0系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析[5]。通過模式識別，構(gòu)建得到主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)模型。

1.4 血漿標志代謝物及相關(guān)代謝通路篩選 根據(jù)離子對模型的貢獻度及置信區(qū)間，初步篩選潛在標志代謝離子。然后利用SPSS22.0軟件對所得變量進行配對樣本非參數(shù)檢驗。將部分特征性代謝離子通過與標準品的色譜峰、質(zhì)譜峰進行比對得到鑒定結(jié)果。無標準品可供對比的特征性代謝離子參照文獻[6]方法進行鑒定：①將特征代謝離子的精確m/z值輸入HMDB(http://hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫，按照m/z偏差不超過0.01的原則、準確電荷數(shù)及與實驗條件相符的電離方式對篩查結(jié)果進行校驗，保留相符的鑒定結(jié)果；②特征離子經(jīng)MS/MS掃描，將二級質(zhì)譜圖與Mass Frontier6.0軟件自帶數(shù)據(jù)庫模擬的鑒定結(jié)果相比對，以比對偏差不超過20%為準。將篩選鑒定出的標志代謝物輸入MetaboAnalyst3.0數(shù)據(jù)庫，進行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組血漿總離子流圖 采用UPLS-MS平臺獲取了病例組PCI手術(shù)前后及對照組的血漿總離子流圖(圖1)。由圖1中可看出，病例組術(shù)前、術(shù)后及對照組的色譜峰分布存在差異。根據(jù)前述數(shù)據(jù)處理方法，通過MZmine2.0軟件從76份樣本中共提取出384種代謝物離子及對應的色譜峰積分面積值。將所得數(shù)據(jù)導入SIMCA-P+12.0.1.0系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析。

圖1 病例組與對照組血漿樣本總離子流圖

2.2 血漿代謝輪廓分析模型 經(jīng)SIMCA-P+12.0.1.0系統(tǒng)分析，得到PCA模型(R2X=42.8%，Q2=9.99%)，共計6個主成分，見圖2。由圖中可看出，病例組手術(shù)前后和對照組的血漿成分有一定聚類趨勢。雖然趨勢并不十分明顯，但可以說明AMI是這一趨勢的主要影響因素。同時構(gòu)建了OPLS-DA模型(R2X=68.6%，R2Y=88.1%，Q2=65.7%)，見圖3。各組間有明顯的聚類區(qū)分趨勢。其中Y軸方向上的趨勢變化反映了AMI患者PCI術(shù)后代謝輪廓轉(zhuǎn)向正常方向，說明AMI患者施行PCI手術(shù)是造成這一聚類趨勢的最主要因素。

圖2 病例組PCI手術(shù)前后血漿樣本PCA模型

圖3 病例組PCI手術(shù)前后血漿樣本OPLS-DA模型

2.3 血漿標志代謝物篩選結(jié)果 提取OPLS-DA模型評分VIP值大于1且可信區(qū)間不包含0的變量。將病例組術(shù)前與對照組數(shù)據(jù)進行非參數(shù)檢驗，共篩選出有統(tǒng)計學差異的代謝物8種，即溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)類物質(zhì)[18∶2(9Z,12Z)]、LysoPC(16∶0) 、LysoPC(18∶0)、LysoPC(P-16∶0)，溶血磷脂酸(LPA)類物質(zhì)[0∶0/18∶1(9Z)]、孕烷三醇(Pregnanetriol)、N-軟脂?；拾贝?N-Palmitoylsphingosine)，神經(jīng)酰胺類物質(zhì)Cer(d18∶0/16∶0)，具體見表2。比較病例組手術(shù)前后上述8種特征性代謝物水平，發(fā)現(xiàn)LysoPC[18∶2(9Z,12Z)]、LysoPC(16∶0)、Pregnanetriol、LysoPC(P-16∶0)、N-Palmitoylsphingosine水平在患者PCI術(shù)后有所恢復。

表2 AMI患者特征代謝物鑒定結(jié)果

2.4 代謝物相關(guān)代謝通路分析 根據(jù)病例組術(shù)前與對照組的差異性代謝物，共篩查出與AMI相關(guān)的兩條代謝通路，為甘油磷脂代謝通路和甘油脂類代謝通路，其中甘油磷脂代謝通路差異性更為明顯。通過比對兩條代謝通路發(fā)現(xiàn)，在兩條代謝通路中存在一個共有的受到AMI影響的代謝物，即磷脂酸類物質(zhì)1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate。

3 討論

本研究利用代謝組學研究平臺及相關(guān)分析方法對AMI特征性代謝物進行了研究。研究對象主要為施行PCI的AMI患者。通過分析患者手術(shù)前后血漿代謝輪廓變化以及相關(guān)代謝產(chǎn)物恢復情況，尋找與AMI高度相關(guān)的代謝信息，并根據(jù)患者手術(shù)前后相關(guān)代謝物的恢復情況，對于術(shù)后的干預性治療提供參考。

本研究利用UPLC-MS平臺對血漿樣本進行了分析，構(gòu)建了以模式識別技術(shù)為基礎(chǔ)的代謝輪廓聚類區(qū)分模型。由OPLS-DA模型的聚類區(qū)分趨勢可看出，AMI是造成這一趨勢的最主要原因。而且隨著冠狀動脈的再度開通，患者的血漿代謝輪廓與術(shù)前有明顯差異，并向?qū)φ战M趨近，但仍與對照組存在一定差異。憑借代謝輪廓模型，可直觀地得到AMI患者PCI手術(shù)前后機體內(nèi)小分子內(nèi)源性物質(zhì)的變化態(tài)勢，繼而分析相關(guān)代謝通路，對患者術(shù)后的干預性治療提供建議，為臨床診療提供新思路。

本研究篩選和鑒定出的特征性代謝物所涉及的代謝過程主要包括磷脂代謝、脂肪酸代謝及激素合成等。我們發(fā)現(xiàn)，AMI患者PCI術(shù)前血漿多種溶血磷脂酰膽堿水平與對照組有明顯差異，其中LysoPC[18∶2(9Z,12Z)]、LysoPC(P-16∶0)升高，可能與心肌細胞壞死、細胞膜崩解后大量入血有一定關(guān)系。LysoPC水平升高對機體危害巨大。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，LysoPC參與多種機體內(nèi)生理生化反應過程，其中包括血管內(nèi)皮損傷與炎癥反應，并導致血管硬化[7]。同時，LysoPC在體內(nèi)大量貯存會引起心肌細胞電生理紊亂，引發(fā)心律失常，影響心肌收縮功能[8]。臨床表現(xiàn)為AMI患者患病期間伴隨不同程度的心電生理信號紊亂，甚至發(fā)生室速或室顫等危急癥狀。本研究結(jié)果顯示，LysoPC[18∶2(9Z,12Z)]和LysoPC(P-16∶0)由于AMI的影響表現(xiàn)出一定的升高趨勢，隨著PCI手術(shù)的實施，上述兩種特征性代謝產(chǎn)物恢復至與對照組相近的水平，或有一定恢復趨勢。

另外，LysoPC(16∶0)、LysoPC(18∶0)呈現(xiàn)出下降趨勢，同時發(fā)現(xiàn)，磷脂酸類物質(zhì)LPA[0∶0/18∶1(9Z)]亦在AMI患者術(shù)前組呈下降趨勢，這一變化應該與磷脂酸類物質(zhì)引起的細胞外鈣離子內(nèi)流動員效應有關(guān)[9]，同時也提示心肌收縮力下降[10]。隨著冠狀動脈的再度開通，LysoPC(16∶0)恢復至與對照組相近的水平，然而LysoPC(18∶0)和LPA[0∶0/18∶1(9Z)]仍然保持在與術(shù)前相近的低水平，此現(xiàn)象提醒臨床醫(yī)師及研究者應高度重視此兩種代謝產(chǎn)物的變化，可給予相關(guān)治療，改善患者預后。

神經(jīng)酰胺(N-軟脂?；拾贝?是重要的信號轉(zhuǎn)導代謝產(chǎn)物。神經(jīng)酰胺已被證實參與多種心血管功能的調(diào)節(jié)，包括心肌舒縮功能[11]、血管舒縮反應[12]及內(nèi)皮功能[13～15]?？傮w來說，神經(jīng)酰胺參與多種心血管疾病的發(fā)病過程[16～18]，只有極少數(shù)情況下起保護作用[19]。本研究結(jié)果顯示，AMI患者的血漿神經(jīng)酰胺水平明顯低于對照組，考慮是由于低水平神經(jīng)酰胺釋放進入血液循環(huán)，或神經(jīng)酰胺磷酸化增加導致的，這一結(jié)果與Xu等[20]及Luan等[21]的研究一致。通過對比患者PCI手術(shù)前后代謝物水平發(fā)現(xiàn)，患者在經(jīng)過PCI手術(shù)后，血漿中N-軟脂酰基鞘氨醇恢復到與對照組相近水平，而神經(jīng)酰胺類物質(zhì)Cer(d18∶0/16∶0)仍然維持在術(shù)前水平，提醒臨床醫(yī)師或可使用相關(guān)藥物使此類代謝物水平恢復正常，避免此類物質(zhì)代謝紊亂造成不良后果。

孕烷三醇是17-α-羥孕酮的一種代謝產(chǎn)物，AMI患者術(shù)前孕烷三醇水平較對照組明顯升高，可在一定程度上反映患者體內(nèi)羥孕酮升高。研究[22]表明，羥孕酮可降低體內(nèi)HDL水平，上調(diào)低密度脂蛋白LDL水平。所以，孕烷三醇在一定程度上可提示冠心病或AMI的發(fā)生。我們通過對孕烷三醇手術(shù)前后水平統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，隨著患者冠狀動脈血流恢復，孕烷三醇的血漿水平亦得到恢復。

本研究通過對上述代謝產(chǎn)物進行鑒定，篩選出了與AMI相關(guān)的兩條代謝通路，即甘油磷脂代謝通路和甘油脂類代謝通路。在兩條代謝通路中存在一個共有的受到AMI影響的代謝物，即磷脂酸類物質(zhì)1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate，同時也是上述兩條代謝通路的交匯點。磷脂酸是一種具有生物活性的脂質(zhì)，廣泛參與人體生理生化反應，如血小板聚集、平滑肌收縮、心肌舒縮等。提示廣大臨床醫(yī)師及研究者應提高對此類物質(zhì)的重視。

總之，本研究從代謝通路、細胞信號傳導等層面對AMI進行了研究與分析，得到了AMI患者和健康人群的代謝譜差異，并篩選出與AMI高度相關(guān)的特征代謝物。這些特征代謝物隨著疾病進程所產(chǎn)生的變化多指向甘油磷脂類物質(zhì)代謝通路異常，對這一通路進行深入研究有助于發(fā)現(xiàn)AMI新的治療靶點及高度相關(guān)的危險因子。同時，對比患者PCI手術(shù)前后的血漿代謝輪廓及代謝標志物，發(fā)現(xiàn)部分代謝物并未恢復正常，對這些特征性代謝物深入研究，分析其代謝通路，可為防止疾病復發(fā)、改善患者預后提供參考。

參考文獻：

[1] 張嘯飛,胡大一,丁榮晶,等.中國心腦血管疾病死亡現(xiàn)況及流行趨勢[J].中華心血管病雜志,2012,40(3):179-187.

[2] Lewis GD, Asnani A, Gerszten RE. Application of metabolomics to cardiovascular biomarker and pathway discovery[J]. J Am Coll Cardiol, 2008,52(2):117-123.

[3] 張立,馬亞楠,張磊,等.乙肝相關(guān)性肝癌手術(shù)前后血清代謝輪廓分析及特征代謝物篩選[J].中華肝膽外科雜志,2013,19(2):81-87.

[4] Katajamaa M, Oresic M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data[J]. BMC Bioinformatics, 2005,6:179-190.

[5] 陳靜,單圓鴻,嚴沁,等.一種基于液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)進行血清代謝組學研究的方法:從代謝指紋到潛在標志物[J].中國科學化學,2009,39(10):1268-1276.

[6] Nie CY, Han T, Zhang L, et al. Cross-sectional and dynamic change of serum metabolite profiling for hepatitis B-related acute-on-chronic liver failure by UPLC/MS[J]. J Viral Hepat, 2014,21(1):53-63.

[7] Mannheim D, Herrmann J, Versari D, et al. Enhanced expression of Lp-PLA2 and Lysophosphatidylcholine in Symptomatic Carotid Atherosclerotic Plaques[J]. Stroke, 2008,39(5): 1448-1455.

[8] 鄭明奇,劉剛,田立.溶血磷脂酰膽堿對T型鈣離子通道的心肌細胞內(nèi)信號調(diào)控機制[J].中華心臟與心率電子雜志,2013,1(1):24-26.

[9] Van Brocklyn JR, Williams JB. The control of balance between ceramide and sphingosine-1-phosphate by sphingosine kinase: oxidative stress and the seesaw of cell survival and death[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Bio, 2012,163(1): 26-36.

[10] Cremers B, Flesch M, Kostenis E, et al. Modulation of myocardial contractility by lysophosphatidic acid[J]. J Mol Cell Cardiol, 2003,35(1):71-80.

[11] Simon JN, Chowdhury SA, Warren CM, et al. Ceramide-mediated depression in cardiomyocyte contractility through PKC activation and modulation of myofilament protein phosphorylation[J]. Basic Res Cardiol, 2014,109(6):445-471.

[12] Moreno L, Moral-Sanz J, Morals-Cano D, et al. Ceramide mediates acute oxygen sensing in vascular tissues[J]. Antioxid Redox Signal, 2014,20(1):1-14.

[13] Zhang DX, Zou AP, Li PL. Ceramide-induced activation of NADPH oxidase and endothelial dysfunction in small coronary arteries[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003,284(2): H605-612.

[14] Alewijnes AE, Peters SL, Michel MC. Cardiovascular effect of sphingosine-1-phosphate and other sphingomyelin metabolites[J]. Br J Pharmacol, 2004,143(6):666-684.

[15] Novqorodov SA, Gudz TI. Ceramide and mitochondria in ischemia/reperfusion[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2009,53(3):198-208.

[16] Zhang H, Li J, Li L, et al. Ceramide enhances COX-2 expression and VSMC contractile hyperreactivity via ER stress signal activation[J]. Vascul Pharmacol, 2017(96-98):26-32.

[17] Leonardini A, D′Oria R, Incalza MA, et al. GLP-1 receptor activation inhibits palmitate-induced apoptosis via ceramide in human cardiac progenitor cell[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2017,102(11):4136-4147.

[18] Li X, Becker KA, Zhang Y. Ceramide in redox signaling and cardiovascular disease[J]. Cell Physiol Biochem, 2010,26(1):41-48.

[19] Chen I, Ginis Y, Hallenbeck JM. The protective effect of ceramide in immature rat brain hypoxia-ischemia involves upregulation of Bcl-2 and reduction of TUNEL-positive cells[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2001,21(1):34-40.

[20] Xu XB, Gao BB, Guan QJ, et al. Metabolomic profile for the early detection of coronary artery disease by using UPLC-QTOF/MS[J]. J Pharmaceut Biomed, 2016,129:34-42.

[21] Luan HM, Chen XM, Zhong SL, et al. Serum metabolomics reveals lipid metabolism variation between coronary artery disease and congestive heart failure: a pilot study[J]. Biomarker, 2013,18(4):314-321.

[22] LaRosa JC. Women, lipoproteins, cardiovascular disease risk[J]. Can J Cardiol, 1990,6(Suppl B):23-29.