α-乳香酸灌胃對小鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用及其機(jī)制探討

柳敏娜，劉天龍，劉利敏，楊振，段夢露，孫世仁

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院，西安710032)

腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期的共同病理過程[1]。相比腎小球及腎臟血管疾病，間質(zhì)纖維化在腎單位功能損失中扮演重要角色[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)被認(rèn)為是關(guān)鍵的促纖維化細(xì)胞因子，其主要通過激活下游Smad家族蛋白表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生。因此，抑制TGF-β/Smad通路有助于緩解腎間質(zhì)纖維化，保護(hù)腎功能[3]。大量研究[4,5]表明，中藥及其有效成分可通過抑制該通路發(fā)揮抗腎纖維化作用，延緩腎臟疾病進(jìn)展。α-乳香酸是乳香藥材經(jīng)過提取、分離、純化后的產(chǎn)物。前期研究發(fā)現(xiàn)，乳香酸可以通過抑制TGF-β/Smad通路逆轉(zhuǎn)血管纖維化[6]，提示乳香酸有潛在的抗腎纖維化作用。本研究分別以小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎、腎小管上皮細(xì)胞缺氧處理模擬腎臟纖維化動物模型和細(xì)胞模型，觀察α-乳香酸對腎間質(zhì)纖維化的防治作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物、細(xì)胞與主要材料 SPF級C57/BL雄性小鼠52只由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自美國ATCC細(xì)胞庫。α-乳香酸(純度≥98%、批號20150306)購自寶雞辰光生物有限公司。尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(t-SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白定量試劑盒購自西安飛揚(yáng)生物科技有限公司。兔抗α-SMA抗體、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗TGF-β1、Smad2/3和Smad7抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司。

1.2 α-乳香酸對小鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用觀察

1.2.1 腎間質(zhì)纖維化誘導(dǎo)及α-乳香酸給藥方法 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和乳香酸組，每組14只。模型組和乳香酸組參照文獻(xiàn)[7]方法行單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)手術(shù)誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化：小鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，仰臥位固定，從左下側(cè)腹部縱切打開腹腔，分離左側(cè)輸尿管后在中段位置結(jié)扎，縫合腹腔。假手術(shù)組只分離輸尿管但不結(jié)扎，其余操作與模型組一致。造模后第1天乳香酸組用α-乳香酸60 mg/kg灌胃，連續(xù)給藥21 d。

1.2.2 血清腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測 給藥結(jié)束后麻醉大鼠，摘眼球取血。血液在常溫下3 000 r/min離心10 min獲得血清。根據(jù)試劑盒說明書檢測血清BUN、Scr、MDA和t-SOD。

1.2.3 腎臟組織病理觀察 小鼠麻醉后，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，取左側(cè)腎臟，放入4%多聚甲醛繼續(xù)固定48 h。隨后進(jìn)行石蠟包埋、5 μm厚切片。各組組織切片分別進(jìn)行HE染色和MASSON染色。參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷評分和間質(zhì)纖維化評分。

1.2.4 腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA mRNA及蛋白檢測 取各組小鼠腎臟組織，提取總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。用10%的SDS-PAGE電泳膠分離蛋白，每個孔上樣量為10 μg。將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用抗TGF-β1抗體(1∶1 000)、α-SMA抗體(1∶1 000)、Smad2/3抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。二抗在室溫下孵育1 h，洗滌后用ECL發(fā)光液發(fā)光，用BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光采集，用Image J軟件分析蛋白相對表達(dá)量。小鼠腎臟組織中的總RNA根據(jù)QIAGEN RNeasy Mini試劑盒操作說明提取。引物由Primer5.0軟件設(shè)計。TGF-β1上游引物序列為5′-TGGCCAGATCCTGTCCAAAC-3′，下游引物序列為5′-GCGGGTGACCTCTTTAGCAT-3′；Smad2上游引物序列為5′-TCGGCACACGGAGATTCTAAC-3′，下游引物序列為5′-ACCAGAATGCAGGTTCCGAG-3′；Smad3上游引物序列為5′-CCGTGGAACTTACAAGGCGAC-3′，下游引物序列為5′-GGCAGCAAATTCCTGGTTGT-3′；Smad7上游引物序列為5′-TCTCAAACCAACTGGCTGTCC-3′，下游引物序列為5′-AGAGCCTCCCCACGCGA-3′；α-SMA上游引物序列為5′-GTTTCTCGCACGTCTCCTCT-3′，下游引物序列為5′-CAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-AGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3′，下游引物序列為5′-ATGGGCTTCCCGTTGATGAC-3′。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火31 s，72 ℃延伸40 s。共進(jìn)行40個反應(yīng)。

1.3 α-乳香酸對HK-2細(xì)胞的抗纖維化作用觀察 HK-2細(xì)胞復(fù)蘇后，在DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、21% O2、5% CO2。將HK-2細(xì)胞分為對照組、實(shí)驗1組、實(shí)驗2組。實(shí)驗1、2組放入三氣培養(yǎng)箱中(37 ℃、1% O2、5% CO2)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗2組缺氧處理前在培養(yǎng)基中加入25 μg/mL的α-乳香酸。培養(yǎng)48 h后采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白，方法參考“1.2.4”。

2 結(jié)果

2.1 α-乳香酸對小鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用

2.1.1 各組小鼠血清BUN、Scr、MDA水平比較 模型組小鼠血清BUN、Scr、MDA水平高于假手術(shù)組，SOD水平低于假手術(shù)組(P均<0.01)。乳香酸組小鼠血清BUN、Scr、MDA水平低于模型組，SOD水平高于模型組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠血清BUN、Scr、SOD、MDA水平比較

注：與假手術(shù)組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05；與模型組相比，##P<0.01。

2.1.2 各組小鼠腎臟組織病理變化 HE結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠腎臟組織未見明顯病理改變。模型組腎小管上皮細(xì)胞萎縮、排列錯亂，正常結(jié)構(gòu)消失，腎小球硬化，腎小管管腔擴(kuò)張，間質(zhì)纖維組織增生，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤。模型組、假手術(shù)組、乳香酸組腎小管間質(zhì)損傷評分分別為(8.66±1.22)、(0.65±0.18)、(5.21±1.03)分，模型組腎小管間質(zhì)損傷評分高于假手術(shù)組，乳香酸組低于模型組(P均<0.05)。MASSON染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組小鼠腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，膠原染色主要集中在小管基底膜、腎小球系膜及毛細(xì)血管周圍，小管周圍間質(zhì)無染色。模型組腎小管間質(zhì)可見大量藍(lán)色膠原沉積，間質(zhì)纖維組織增生；乳香酸組腎小管間質(zhì)纖維化程度較模型組明顯減輕。模型組、假手術(shù)組、乳香酸組間質(zhì)纖維化評分分別為(2.98±0.43)、(0.26±0.13)、(1.74±0.27)分，模型組間質(zhì)纖維化評分高于假手術(shù)組，乳香酸組間質(zhì)纖維化評分低于模型組(P均<0.05)。詳見圖1。

注：A為HE染色結(jié)果；B為MASSON染色結(jié)果。

圖1各組小鼠腎臟組織病理變化

2.1.3 各組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)比較 模型組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達(dá)量高于假手術(shù)組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量低于假手術(shù)組(P均<0.05)。乳香酸組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達(dá)量低于模型組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量高于模型組(P均<0.05)。見圖2、表2。

2.2 α-乳香酸對HK-2細(xì)胞的抗纖維化作用 實(shí)驗1組細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA相對表達(dá)量高于對照組，Smad7相對表達(dá)量低于對照組(P均<0.05)；實(shí)驗2組TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA相對表達(dá)量低于實(shí)驗1組，Smad7相對表達(dá)量高于實(shí)驗1組(P均<0.05)。見圖3、表3。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致終末期腎病的主要病理機(jī)制，可進(jìn)展為腎衰竭而危及生命[9]。近年來，中藥在腎間質(zhì)纖維化的治療上效果顯著。前期研究表明，乳香酸有很好的抗纖維化作用[6]，但乳香酸對腎間質(zhì)纖維化的治療作用未見報道。本文擬對乳香酸的主要成分之一α-乳香酸對腎臟纖維化的防治作用進(jìn)行研究，并進(jìn)一步探討機(jī)制。預(yù)實(shí)驗首先確定了α-乳香酸對小鼠和HK-2細(xì)胞抗腎臟纖維化的最佳藥物濃度分別為60 mg/kg和25 μg/mL。

圖2 各組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表達(dá)情況

圖3 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表達(dá)情況

組別TGF?β1mRNA蛋白Smad2mRNA蛋白Smad3mRNA蛋白Smad7mRNA蛋白α?SMAmRNA蛋白假手術(shù)組1．01±0．280．92±0．091．07±0．171．03±0．141．04±0．210．99±0．181．11±0．141．02±0．180．95±0．221．09±0．23模型組4．51±0．99??3．77±1．05??2．84±0．38?1．96±0．22?2．86±0．75?3．55±1．01??0．54±0．19?0．36±0．12??3．17±0．62??2．99±0．43??乳香酸組2．91±0．47#1．84±0．32#1．77±0．32#1．37±0．18#1．79±0．24#2．71±0．63#0．85±0．14#0．69±0．13#1．89±0．35#1．60±0．26##

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

表3 各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表達(dá)比較

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與實(shí)驗1組相比，#P<0.05。

我們先觀察了α-乳香酸對小鼠腎間質(zhì)纖維化的防治作用。Scr和BUN是反映腎功能的常用指標(biāo)，二者水平增高與腎臟疾病進(jìn)展呈正相關(guān)[10]。當(dāng)體內(nèi)MDA水平增高、SOD活性下降時，機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)，而抗氧化能力減弱，最終導(dǎo)致腎組織損傷。本研究結(jié)果顯示，模型小鼠在輸尿管結(jié)扎手術(shù)21 d后，血清Scr、BUN水平顯著升高，表明手術(shù)成功誘導(dǎo)了小鼠腎功能損傷；同時血清MDA水平增高、SOD活力降低，表明造模后小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。而乳香酸組小鼠經(jīng)α-乳香酸治療后，血清Scr、BUN、MDA水平降低，SOD活力增高，提示α-乳香酸具有腎保護(hù)作用。同時，各組小鼠腎臟組織病理檢查結(jié)果顯示，模型組小鼠腎小管變形，可見明顯水腫和炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)周圍膠原沉積顯著，表明模型組小鼠發(fā)生腎纖維化病理改變。而給予α-乳香酸灌胃后，腎臟病理結(jié)構(gòu)變化有顯著改善，腎小管間質(zhì)損傷和間質(zhì)纖維化程度減輕，表明α-乳香酸有抗腎臟纖維化的作用。

為了進(jìn)一步探究α-乳香酸抗纖維化的作用機(jī)制，我們觀察了各組小鼠腎臟組織中纖維化相關(guān)分子的表達(dá)變化。TGF-β1參與誘導(dǎo)腎臟纖維化的多個環(huán)節(jié)，是重要的促纖維化因子[11]?；罨腡GF-β1可調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)。大量研究表明，在與間質(zhì)纖維化相關(guān)的腎臟疾病中，TGF-β1表達(dá)都顯著升高[12,13]。而抑制TGF-β1的生物活性可減緩纖維化進(jìn)程[14]。本研究中，模型組腎臟組織中TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，給藥后顯著下降，提示α-乳香酸可通過抑制TGF-β1的表達(dá)起到抗腎臟纖維化的作用。

Smad家族是TGF-β誘導(dǎo)的纖維化過程中關(guān)鍵的下游調(diào)節(jié)因子，在TGF-β的刺激下，Smad2和Smad3發(fā)生磷酸化，進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[15]。研究表明，慢性腎臟病樣本中Smad2、Smad3水平較正常組織高[16]，抑制二者表達(dá)可有效緩解纖維化[17]。Smad7是一種抑制型Smad蛋白，通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β1，抑制Smad2和Smad3的磷酸化。Smad7的過表達(dá)可抑制TGF-β/Smad通路，延緩腎臟纖維化的進(jìn)展[18]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的特征分子，在TGF-β的刺激下，α-SMA表達(dá)升高，成纖維細(xì)胞大量增生[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達(dá)量高于假手術(shù)組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量低于假手術(shù)組；乳香酸組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達(dá)量低于模型組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達(dá)量高于模型組。這提示α-乳香酸可阻斷TGF-β/Smad通路激活，進(jìn)而發(fā)揮抗腎纖維化作用。

腎小管間質(zhì)慢性缺氧是促進(jìn)各種慢性腎臟病進(jìn)展至終末期的共同機(jī)制[20]。HK-2細(xì)胞缺氧處理是體外模擬腎間質(zhì)纖維化的經(jīng)典方法[21]。在本實(shí)驗中，HK-2細(xì)胞經(jīng)過缺氧處理后，細(xì)胞內(nèi)α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、表達(dá)升高，Smad7表達(dá)下調(diào)，給予α-乳香酸處理后，這些蛋白表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，與小鼠體內(nèi)實(shí)驗結(jié)果一致。上述結(jié)果表明α-乳香酸對腎纖維化的防治作用可能是通過下調(diào)TGF-β1、α-SMA表達(dá)和抑制Smad2、Smad3活化來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，α-乳香酸對小鼠腎間質(zhì)纖維化有防治作用，機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad通路有關(guān)。

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