中國(guó)漢族家系痛風(fēng)患者β3腎上腺素受體基因突變觀察

孫雅奇，劉世國(guó)，賀玉偉，李長(zhǎng)貴

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266071)

痛風(fēng)是長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起組織損傷的一組異質(zhì)性疾病，以劇烈疼痛、急慢性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石為臨床特征[1]。遺傳因素是痛風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵因素[2]。研究[3]表明，10%～30%的原發(fā)性痛風(fēng)患者有痛風(fēng)家族史，家系痛風(fēng)(除先證者外，該家系三代以內(nèi)直系親屬還有1例及以上痛風(fēng)患者)與散發(fā)痛風(fēng)在遺傳機(jī)制上存在差異，但目前相關(guān)研究多基于散發(fā)病例，國(guó)內(nèi)外關(guān)于家系痛風(fēng)易感基因的研究較少。β3腎上腺素受體(ADRB3)主要表達(dá)于脂肪組織[4]，多種族大量人群的橫斷面研究與病例對(duì)照試驗(yàn)均提示ADRB3基因是高尿酸血癥和痛風(fēng)形成的易感基因[5～8]。但是目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)展的ADRB3基因與痛風(fēng)和高尿酸血癥遺傳易感性的研究中，研究對(duì)象均為散發(fā)痛風(fēng)患者。為明確ADRB3基因與家系痛風(fēng)遺傳易感性的關(guān)系，本課題組對(duì)中國(guó)漢族家系痛風(fēng)患者進(jìn)行ADRB3基因突變篩查。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 在山東省痛風(fēng)病臨床醫(yī)學(xué)中心已建立的痛風(fēng)遺傳資源庫(kù)中，收集500例來(lái)自不同家系的家系痛風(fēng)先證者(病例組)及500例與痛風(fēng)家系無(wú)關(guān)的正常人(對(duì)照組)。以上人群均接受內(nèi)分泌代謝病?？漆t(yī)生的病史采集和體格檢查，檢測(cè)所有研究對(duì)象的空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇及血尿酸等指標(biāo)。痛風(fēng)診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)診斷標(biāo)準(zhǔn)和2015ACR/EULAR制訂的痛風(fēng)分類診斷標(biāo)準(zhǔn)[9,10]。500例正常對(duì)照納入標(biāo)準(zhǔn)為：血尿酸水平<360 μmol/L；無(wú)痛風(fēng)發(fā)作史；與痛風(fēng)家系無(wú)關(guān)；排除影響尿酸代謝及排泄的疾病如血液系統(tǒng)疾病、慢性腎病、高血壓等；排除應(yīng)用影響尿酸水平的藥物如氫氯噻嗪、阿司匹林、替米沙坦等。兩組研究對(duì)象均為中國(guó)漢族人群。本研究已獲青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。所有參與者已知曉本研究的相關(guān)情況，并簽署知情同意書。

1.2 ADRB3基因突變篩查方法 采用DNA提取標(biāo)準(zhǔn)試劑盒提取兩組外周血基因組DNA。用Nanodrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA的濃度和純度。采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ADRB3所有外顯子，由上海英濰捷基公司合成引物，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[11]。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Bio-Rad凝膠成像儀進(jìn)行圖像掃描，于相應(yīng)位置處可見(jiàn)單一清晰條帶。PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行直接測(cè)序。采用Chromas2.21軟件查看峰圖文件。以GenBank中ADRB3基因外顯子序列(NM000025.2)為參照序列，用DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析。所有突變位點(diǎn)均進(jìn)行反向測(cè)序驗(yàn)證。將發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)在常用基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP、1000genomics、ESP6500、UniProt、ClinVar)中進(jìn)行比對(duì)。新發(fā)突變按照HGVS國(guó)際規(guī)范進(jìn)行命名[12]。

表1 ADRB3基因外顯子片段引物序列

1.3 ADRB3基因突變先證者家系調(diào)查 對(duì)攜帶ADRB3基因突變的家系痛風(fēng)先證者所在家系成員進(jìn)行調(diào)查。家系中三代以內(nèi)直系親屬均接受內(nèi)分泌代謝病?？漆t(yī)生的病史采集、體格檢查、外周血樣本采集和血生化檢查。家系外周血樣本均提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)ADRB3基因外顯子測(cè)序并分析。

2 結(jié)果

2例家系痛風(fēng)先證者ADRB3基因3′-非翻譯區(qū)(UTR)存在雜合突變c.*660C>T，即ADRB3基因3′-UTR第660位堿基存在C>T的雜合性突變。該突變?cè)趯?duì)照組中不存在，常用基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)如dbSNP、1000genomics、ESP6500、UniProt、ClinVar中未發(fā)現(xiàn)此突變，國(guó)內(nèi)外研究也未見(jiàn)報(bào)道，為新發(fā)突變。基因突變及正常測(cè)序峰圖見(jiàn)圖1。

1例攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的先證者所屬家系共11例家系成員中，5例為痛風(fēng)患者。通過(guò)家系系譜圖(圖2)分析該家系痛風(fēng)的遺傳特征：每代均有痛風(fēng)患者，父母中有痛風(fēng)患者則子女有50%概率發(fā)病，父母中無(wú)痛風(fēng)患者則子女無(wú)人患病。男女發(fā)病機(jī)會(huì)均等，該家系痛風(fēng)符合常染色體顯性遺傳。該家系中5例痛風(fēng)患者均攜帶ADRB3 c.*660C>T突變，而非痛風(fēng)患者不攜帶此突變，基因型與表型共分離。5例痛風(fēng)患者測(cè)序峰圖見(jiàn)圖3。該家系痛風(fēng)患者臨床資料見(jiàn)表2。Ⅲ2為先證者，20歲，18歲發(fā)病，血尿酸665 μmol/L(正常值為<420 μmol/L)，首發(fā)關(guān)節(jié)為足背部，并累及第一跖趾關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)；查體身高192 cm，體質(zhì)量110 kg，BMI 29.8 kg/m2；血壓、空腹血糖、甘油三酯、膽固醇均未發(fā)現(xiàn)異常。所有痛風(fēng)患者血尿酸498～694(595±75)μmol/L，明顯高于正常。非痛風(fēng)患者血尿酸水平正常。5例痛風(fēng)患者查體BMI (27.9±1.7)kg/m2、空腹血糖(7.1±0.9)mmol/L、甘油三酯(3.28±1.77)mmol/L、血膽固醇(5.21±0.81)mmol/L，其中合并肥胖、糖尿病、高血壓各3例。見(jiàn)表2。

另外1例攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的先證者37歲，就診時(shí)首次發(fā)病，第一跖趾關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)發(fā)紅，血尿酸434 μmol/L；所屬家系中僅其祖父為痛風(fēng)患者，已去世，未獲得其血液樣本；該家系其他成員拒絕參加本研究。

注：A、B分別為2例家系痛風(fēng)先證者ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T峰圖，箭頭所指處為雜合突變；C為不攜帶該突變的正常對(duì)照測(cè)序峰圖，箭頭所示無(wú)突變。

圖12例家系痛風(fēng)先證者ADRB3基因3′-UTR雜合突變示意圖

圖2 攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的痛風(fēng)家系系譜圖(箭頭所指為先證者)

注：箭頭所指為ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T。

圖3攜帶ADRB3c.*660C>T突變的1例痛風(fēng)家系中5例痛風(fēng)患者ADRB3基因突變示意圖

3 討論

痛風(fēng)是多基因遺傳病，其發(fā)病是環(huán)境因素與多個(gè)易感基因共同作用的結(jié)果[13]。多項(xiàng)研究顯示ADRB3基因是高尿酸血癥和痛風(fēng)形成的易感基因[5～8]。Wang等[5]對(duì)中國(guó)漢族男性421例痛風(fēng)患者和312例正常人進(jìn)行病例對(duì)照研究，結(jié)果顯示rs4994(Trp64Arg)位點(diǎn)與中國(guó)漢族男性痛風(fēng)呈強(qiáng)相關(guān)，Arg64等位基因攜帶者患痛風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，提示ADRB3基因是中國(guó)漢族男性痛風(fēng)的易感基因。有學(xué)者[7]對(duì)新西蘭人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ADRB3基因rs4994(Trp64Arg)位點(diǎn)在校正腎臟疾病的影響后與痛風(fēng)存在關(guān)聯(lián)性。Huang等[6]發(fā)現(xiàn)rs4994(Trp64Arg)位點(diǎn)與高尿酸血癥呈強(qiáng)相關(guān)，Arg64等位基因攜帶者患高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。但以上研究對(duì)象均為散發(fā)痛風(fēng)患者。目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)ADRB3基因與家系痛風(fēng)遺傳易感性之間的報(bào)道。

表2 攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的1例痛風(fēng)家系中5例痛風(fēng)患者臨床資料

本研究選擇山東省痛風(fēng)病臨床醫(yī)學(xué)中心痛風(fēng)遺傳資源庫(kù)收集的500例來(lái)自不同家系的家系痛風(fēng)先證者，以及500例與以上家系無(wú)關(guān)的正常對(duì)照，選擇中國(guó)漢族原發(fā)性痛風(fēng)易感基因ADRB3外顯子進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)2例家系痛風(fēng)先證者存在ADRB3基因3′-UTR新發(fā)突變c.*660C>T。其中一個(gè)家系共三代11人，包括5例患者(男4例、女1例)，6例正常人。5例患者均攜帶ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T，而正常人不攜帶。該痛風(fēng)家系具有自己的遺傳特點(diǎn)：每代均有痛風(fēng)患者，男女發(fā)病機(jī)會(huì)均等。痛風(fēng)好發(fā)于男性，發(fā)病高峰年齡在40～50歲[14]，而該家系平均發(fā)病年齡(31±11)歲，比散發(fā)患者發(fā)病早近10歲。第一代中Ⅰ1發(fā)病年齡50歲，第二代中Ⅱ1、Ⅱ3發(fā)病年齡分別為35、31歲，第三代中Ⅲ1、Ⅲ2發(fā)病年齡分別為22、18歲，每一代痛風(fēng)患者發(fā)病年齡均比上一代提前。臨床研究發(fā)現(xiàn)，95%痛風(fēng)患者是男性，女性發(fā)病多在絕經(jīng)期后，而女性患者Ⅱ3發(fā)病時(shí)31歲，屬絕經(jīng)期前發(fā)病[14]。綜上，該家系是典型的常染色體顯性遺傳家系，基因型與表型共分離，呈現(xiàn)遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象，可能為單基因遺傳模式，新發(fā)罕見(jiàn)ADRB3 c.*660C>T突變可能是該家系的致病突變。

人ADRB3基因位于染色體8p12-p11.2，全長(zhǎng)3 672 bp，3′端非編碼區(qū)共1 224 bp[3]。Traget Scan和PicTar軟件預(yù)測(cè)有11種miRNA能與ADRB3基因3′-UTR結(jié)合，即let-7d-5p、let-7g-5p、let-7e-5p、miR-98-5p、let-7i-5p、miR-4500、let-7b-5p、let-7a-5p、let-7f-5p、let-7c-5p。ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T并不位于上述11種miRNA與ADRB3基因3′-UTR的結(jié)合區(qū)域內(nèi)，推測(cè)c.*660C>T突變可能通過(guò)影響miRNA與ADRB3基因3′-UTR結(jié)合或結(jié)合后形成空間構(gòu)象從而導(dǎo)致ADRB3基因異常表達(dá)[15]。功能研究證實(shí)，β3腎上腺素受體功能下降可引起脂肪組織中脂肪分解減少和脂肪酸氧化下降，導(dǎo)致脂肪沉積、血游離脂肪酸升高、脂肪細(xì)胞分泌TNF-α增多，導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗[16]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，3-磷酸甘油脫氫酶活性降低，糖酵解過(guò)程的中間產(chǎn)物向5-磷酸核糖及磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致血尿酸生成增多[17]。此外，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)可引起繼發(fā)性高胰島素血癥，高水平的胰島素及胰島素前體物可刺激腎小管Na+-H+交換，增加H+排泌的同時(shí)使尿酸重吸收增多；還可以通過(guò)影響近端腎小管尿鈉排泄而競(jìng)爭(zhēng)性抑制尿酸的排泄，使血尿酸升高，從而引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[18]。本研究中，5例攜帶ADRB3基因c.*660C>T突變的家系痛風(fēng)患者中合并肥胖、糖尿病各3例，血生化檢查空腹血糖、甘油三酯、膽固醇水平高于正常。結(jié)合基因型與表型，我們推測(cè)ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T可能影響miRNA與ADRB3基因3′-UTR結(jié)合，形成空間構(gòu)象，導(dǎo)致β3腎上腺素受體功能下降，出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗，影響腎尿酸排泄進(jìn)而導(dǎo)致高尿酸血癥，引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)中國(guó)漢族原發(fā)性痛風(fēng)家系中存在ADRB3基因3′-UTR新發(fā)雜合突變c.*660C>T。該突變可能是其中一個(gè)家系的致病突變，但具體致病機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kuo CF, Grainge MJ, Zhang W, et al. Global epidemiology of gout: prevalence, incidence and risk factors [J]. Nat Rev Rheumatol, 2015,11(11):649-662.

[2] Merriman T. Genomic Influences on Hyperuricemia and Gout [J]. Rheu Dis Clin North Am, 2017,43(3):389-399.

[3] Kuo CF, Grainge MJ, See LC, et al. Familial aggregation of gout and relative genetic and environmental contributions: a nationwide population study in Taiwan [J]. Ann Rheum Dis, 2015,74(2):369-374.

[4] Michel MC, Ochodnicky P, Summers RJ. Tissue functions mediated by β3-adrenoceptors-findings and challenges[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2010,382(2):103-108.

[5] Wang B, Meng D, Wang J, et al. Positive correlation between Beta-3-Adrenergic Receptor (ADRB3) gene and gout in a Chinese male population [J]. J Rheumatol, 2011,38(4):738-740.

[6] Huang Q, Zhang LF, Cheng Y, et al. Trp64Arg (rs4994) polymorphism of beta3-adrenergic receptor gene is associated with hyperuricemia in a Chinese male population [J]. Clin Chem Lab Med, 2013,51(9):1755-1760.

[7] Fatima T, Altaf S, Phipps-Green A, et al. Association analysis of the beta-3 adrenergic receptor Trp64Arg (rs4994) polymorphism with urate and gout [J]. Rheumatol Int, 2016,36(2):255-261.

[8] Morcillo S, Rojo-Martinez G, Martin-Nunez GM, et al. Trp64Arg polymorphism of the ADRB3 gene predicts hyperuricemia risk in a population from southern Spain [J]. J Rheumatol, 2010,37(2):417-421.

[9] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì).原發(fā)性痛風(fēng)診斷和治療指南[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2011,6:410-413.

[10] Neogi T, Jansen TL, Dalbeth N, et al. 2015 Gout Classification Criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative [J]. Arthritis Rheumatol, 2015,67(10):2557-2568.

[11] 柴建,楊曉龍,郭明貞,等.先天性甲狀腺功能減退癥患兒DUOX2基因突變的研究[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志,2015, 1:40-44.

[12] Den Dunnen JT, Dalgleish R, Maglott DR, et al. HGVS Recommendations for the Description of Sequence Variants:2016 Update [J]. Hum Mutat, 2016,37(6):564-569.

[13] Reginato AM, Mount DB, Yang I, et al. The genetics of hyperuricaemia and gout [J]. Nat Rev Rheumatol, 2012,8(10):610-621.

[14] 紀(jì)艷,吳秀英,李長(zhǎng)貴,等.原發(fā)性痛風(fēng)家系男性與女性痛風(fēng)病人的比較[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,43(4):357-358.

[15] Ripperger A, Benndorf RA. The C421A (Q141K) polymorphism enhances the 3′-untranslated region (3′-UTR)-dependent regulation of ATP-binding cassette transporter ABCG2 [J]. Biochem Pharmacol, 2016,15(104):139-147.

[16] Perfetti R, Hui H, Chamie K, et al. Pancreatic beta-cells expressing the Arg64 variant of the beta(3)-adrenergic receptor exhibit abnormal insulin secretory activity [J]. J Mol Endocrinol, 2001,27(2):133-144.

[17] Tsunoda S, Kamide K, Minami J, et al. Decreases in serum uric acid by amelioration of insulin resistance in overweight hypertensive patients: effect of a low-energy diet and an insulin-sensitizing agent [J]. Am J Hypertens, 2002,15(8):697-701.

[18] 金明姬,劉冠賢,石詠軍.高尿酸血癥與胰島素抵抗關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2012, 3:233-236.