缺氧誘導因子抑制劑YC-1對缺氧肝癌細胞生物鐘基因和蛋白表達及增殖的影響

許靜，孫誠誼，喻超，何曉曉，楊盛力

(1貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴陽550000；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院；3華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院)

生物鐘是生物體生命活動的內在節(jié)律，在長遠的進化過程中已趨于穩(wěn)定。生物鐘主要由Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε、Clock、BMAL1、NPAS2和Rev-Erbα等基因調控[1，2]。生物鐘基因表達異?？蓪е律锕?jié)律紊亂，影響細胞生長、代謝和損傷修復，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[3]。如Per1、Per2、Per3、Bmal1等通過誘導細胞凋亡從而抑制腫瘤的發(fā)生；Clock則促進腫瘤的侵襲與轉移[4～7]。腫瘤最突出的特性之一即生長快速，隨著細胞數(shù)量、體積的快速增加，腫瘤內部的血液供應相對不足，形成缺氧微環(huán)境[8，9]。缺氧信號通路阻斷劑YC-1由人工合成，可抑制低氧誘導因子1(HIF-1)的表達，并抑制血管內皮生長因子(VEGF)表達，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[10～12]。在腫瘤組織中，普遍存在著生物鐘基因表達異常。肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展與生物鐘表達紊亂亦關系密切[13]。然而目前對于生物鐘基因表達變化與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機制尚不明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧微環(huán)境可引起肝癌細胞中生物鐘基因表達紊亂[14]。本研究中，我們將通過三氣培養(yǎng)箱模擬體內缺氧微環(huán)境，觀察YC-1對缺氧肝癌細胞中生物鐘基因、蛋白表達及細胞增殖的影響，進一步探索生物鐘基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購于美國Hyclone公司。PCR引物購于Invitrogen公司。RNA提取試劑TRIzol、PCR試劑SYBR Green PCR Master Mix及PCR引物合成由Life公司提供。鼠抗人Cry1單克隆抗體、兔抗人Cry2多克隆抗體、兔抗人Clock多克隆抗體、兔抗人Bmal1多克隆抗體均購于Abcam公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司。鼠抗人Per1、Per2、Per3多克隆抗體由Novus公司提供。

1.2 YC-1對缺氧肝癌細胞生物鐘基因和蛋白表達的影響觀察

1.2.1 Huh7細胞培養(yǎng)與分組 將肝癌細胞Huh7接種于6孔板中，置于缺氧培養(yǎng)箱中，按氧氣1%、氮氣74%、二氧化碳25%的比例持續(xù)通入氣體，待Huh7細胞生長至75%融合時，將細胞分為實驗組和對照組，分別加入等量的DMSO和50 μmol/L的YC-1。

1.2.2 Huh7細胞中生物鐘基因檢測 采用real-time PCR法檢測兩組細胞中的Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1 mRNA。兩組于培養(yǎng)48 h后用TRIzol試劑提取出RNA，測量提取RNA的濃度及純度，取等量RNA并逆轉錄為cDNA，根據(jù)試劑盒說明書進行定量PCR反應，每個反應設3個復孔。PCR總反應體系為20 μL，包括SYBR Green Mix 10 μL、cDNA模板1.5 μL、10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL、ddH2O 6.5 μL。以β-actin為內參。生物鐘基因及內參基因引物序列見表1。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

表1 生物鐘基因及內參基因引物序列

1.2.3 Huh7細胞中生物鐘基因蛋白檢測 采用Western blotting法檢測兩組細胞中的Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1蛋白。提取兩組細胞總蛋白，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉移到PVDF膜上，封閉2 h后，孵育一抗、二抗，ECL法顯色，計算機掃描蛋白質條帶后進行灰度分析。以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

監(jiān)測點的布設是環(huán)境監(jiān)測質量保證過程中最為關鍵的基礎環(huán)節(jié)，決定了樣品的代表性。大氣監(jiān)測樣點在污染源分散的情況下，采用網(wǎng)格布點法、功能區(qū)布點法、同心圓布點法或扇形布點法等。在實際工作中，為達到因地制宜，往往采取以一種布點方法為主，兼用其他方法的綜合布點法。對于某一河段的監(jiān)測，一般只需設置對照、控制和消解三種斷面，再根據(jù)水面的深度和寬度確定具體的采樣點。例如，當水面寬度不大于50 m時，只設一個中泓垂線；在一條垂線上，當水深不大于5 m時，只在水面下0.5 m處設一個采樣點。

[14] Bhatti P, Cushing-Haugen KL, Wicklund KG, et al. Nightshift work and risk of ovarian cancer[J]. Occup Environ Med, 2013,70(4):231-237.

2 結果

2.1 兩組細胞中生物鐘基因表達比較 實驗組細胞中Clock、Per1、Per3、Cry1 mRNA相對表達量低于對照組，Bmal1、Per2、Cry2 mRNA相對表達量高于對照組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 兩組細胞中生物鐘基因表達比較

2.2 兩組細胞中生物鐘基因蛋白表達比較 實驗組細胞中Clock、Per1、Per3、Cry1蛋白相對表達量低于對照組，Bmal1、Per2、Cry2蛋白相對表達量高于對照組(P均<0.05)。詳見表3、圖1。

表3 兩組細胞中生物鐘基因蛋白表達比較

圖1 兩組細胞中Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1蛋白表達情況

2.3 兩組細胞克隆形成情況比較 實驗組克隆形成個數(shù)為83個、克隆形成率為27.67%，對照組分別為191個、63.67%，實驗組克隆形成個數(shù)及克隆形成率均低于對照組(P均<0.05)。詳見圖2。

3 討論

筆者結合微課有關特點，按照課堂教學內容與形式，分門別類將不同教學內容與微課進行整合，促進微課教學根植于課堂教學之中。

圖2 兩組細胞克隆形成情況

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導的缺氧條件可導致肝癌細胞中生物鐘基因表達改變，表明缺氧可導致生物鐘基因表達異常[18]。YC-1由人工合成，是HIF-1α的阻滯劑，其作用機制是抑制HIF-1α的表達并誘導缺氧依賴性細胞的特異性凋亡，同時產生活性氧簇(ROS)，從而將無氧的糖酵解轉化為有氧的氧化磷酸化；若加入葡萄糖和胰島素，能使YC-1特異性誘導細胞凋亡時產生的ROS量增加，從而增強抑制腫瘤生長的功能[11，12]。

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參考文獻：

結合上述研究結果，我們認為，YC-1作用后，缺氧環(huán)境下的肝癌細胞中Clock、Per1、Per3、Cry1基因及蛋白表達下調，Bmal1、Per2、Cry2基因及蛋白表達上調，細胞增殖和克隆形成能力減弱。YC-1雖然不能完全逆轉缺氧對肝癌細胞中生物鐘基因表達的影響，但其可抑制肝癌細胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。借鑒YC-1聯(lián)合低劑量胰島素和葡萄糖增強抗腫瘤作用的研究成果[11,19,20]，可考慮尋找其他能影響肝癌細胞生物鐘基因表達的因子，與YC-1協(xié)同作用，共同遏制腫瘤的生長。

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他給馬云寫信，倡議淘寶大學給宗教人士免費開課，并許諾自己將創(chuàng)造一個奇跡，“人生出一次家，是多么的重要。要把出家與還俗，看成是在淘寶上開店與關門一樣簡單與順理成章。那么我們的人生就更容易看破放下?！?/p>

邢雙雙等[8]認為護理質量評價指標體系應覆蓋臨床常見病和多發(fā)病，應利于臨床?？剖褂?，應明確各個指標的界定標準。本研究指標體系包括15項安全及消毒隔離敏感指標，9項護理記錄及評估敏感指標，12項醫(yī)囑執(zhí)行及服務流程敏感指標，3項輸血專項敏感指標，內容涵蓋護理質量過程和結局，適宜各類病人使用及臨床各護理單元的護理質量管理。

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為使研究結果更具嚴謹性，以及盡可能減少其他變量的影響，本研究所用的肝癌細胞均處于對數(shù)生長期，避免了部分細胞衰老等自身因素對基因表達的影響。本研究結果顯示，實驗組細胞中Clock、Per1、Per3、Cry1 mRNA及蛋白相對表達量低于對照組，Bmal1、Per2、Cry2 mRNA及蛋白相對表達量高于對照組，提示缺氧信號通路阻斷劑YC-1僅能影響肝癌細胞由缺氧引起的部分生物鐘基因的表達紊亂，而不能起到完全逆轉的作用。為研究YC-1對肝癌細胞增殖的影響，我們進行了克隆形成實驗，結果顯示，經(jīng)YC-1作用后，實驗組克隆形成率明顯降低，表明YC-1能夠抑制肝癌細胞的增殖。然而克隆形成率只能宏觀地顯示細胞增殖的多與少，而不能解釋影響細胞增殖的機制，這是本研究的局限所在。

富馬酸喹硫平是一種新型二苯氧氮雜卓類的多種神經(jīng)遞質受體拮抗劑，對于5‐HT2、D1、D2、H1與α1受體均具有較高親和力，主要用于精神分裂癥、情感障礙和抑郁癥的治療，臨床不良反應發(fā)生率較少，目前富馬酸喹硫平已成為精神分裂癥與雙向情感障礙及抑郁癥治療的一線用藥［1‐3］，中國精神分裂癥防治指南（2007版）將其作為臨床一線藥物進行推薦。

隨著科學的發(fā)展，生物鐘逐漸走入人們的視野，其對晝夜節(jié)律的干擾、對內分泌性疾病的促進，以及在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的重要作用正逐步被發(fā)現(xiàn)。生命的生物節(jié)律離不開生物鐘的調控，而生物鐘在分子水平上受多個生物鐘基因的共同影響，包括原癌基因、抑癌基因、細胞周期調控因子、血管生成相關基因和轉移相關基因等，如Per1、Per2、Per3、Clock、Bmal1、Cry1、Cry2、NPAS2、CKIε、Tim、Rev-Erb、DEC等[1，2]。越來越多的臨床數(shù)據(jù)表明，生物節(jié)律紊亂如夜間工作導致的晝夜節(jié)律紊亂，可使生物鐘基因表達紊亂，從而引發(fā)各種腫瘤如胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、前列腺癌等[14～17]。研究[2]表明，對比癌旁正常組織，肝癌組織中Bmal1、NPAS2、DEC1高表達，Per1、Per2、Per3、Cry2則呈低水平表達，說明生物鐘基因的表達與肝癌密切相關。在肝癌組織中高表達而正常組織中低表達的基因可能為癌基因，在癌旁正常組織中高表達而癌組織中低表達的基因可能為抑癌基因，由此推測生物鐘基因的表達影響肝癌的發(fā)生與發(fā)展。同時有研究[18]表明，肝癌細胞中生物鐘基因的表達明顯受環(huán)境含氧條件的影響，在缺氧與常氧條件下的表達結果截然不同，較常氧條件，缺氧時Per1、Cry2、Bmal的表達水平升高，Cry1、Per2、Per3、CKIε、Clock的表達水平降低。但該變化趨勢與生物鐘基因在肝癌組織中的表達僅部分相同，表明還有其他因素影響肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

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地名詞典和測繪學敘詞表都不能稱之為地名本體，因為他們都是規(guī)范化的說明，專業(yè)性較強，而地名本體需要構建的是最廣泛的，最基本的地名概念性內容，需要形式語言(Formal Language)的一般化描述。從使用目的上看，地名詞典和測繪學敘詞表都是檢索工具，是為了方便信息的查詢檢索，而地名本體則是為了表達地名的知識體系，并不僅僅是規(guī)范概念，其所表達的屬性內容較地名詞典和敘詞表更加豐富。

1.3 YC-1對缺氧肝癌細胞增殖的影響觀察 取對數(shù)生長期的Huh7細胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞后收集細胞，加入2個分別含10 mL預溫培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并將密度調整至300/皿。將細胞分為實驗組和對照組，實驗組加入50 μmol/L的YC-1，對照組加入等量0.9%的NaCl溶液。在乏氧條件下(1% O2)培養(yǎng)細胞。當培養(yǎng)皿出現(xiàn)肉眼可見的克隆后，終止培養(yǎng)，棄上清，用PBS洗滌2次，并用5 mL的醋酸、甲醇液(1∶3)固定15 min，然后用Giemsa染色10 min。計數(shù)克隆數(shù)目，計算克隆形成率，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

首先，東博會的品牌發(fā)展還不是特別成熟。近十多年來，隨著南寧東博會的成功舉辦，南寧的會展業(yè)走上了一條高速發(fā)展的道路。但由于南寧經(jīng)濟底子薄，人才吸引力度薄弱，和其他省份相比，我們的會展業(yè)還不夠成熟。東博會相比周邊的廣交會等大型展覽會，實力相差較大，導致其吸引力不強，影響來參加展會的人員數(shù)量和質量，在一定程度上也影響其會展旅游以及南寧的整體旅游。

若圖像中存在撒料區(qū)域，則使用區(qū)域生長算法對紅外圖像數(shù)據(jù)進行撒料區(qū)域分割，它將具有某種相似性質的像素或體集合起來構成區(qū)域.其基本思想是，在檢測區(qū)域中設置一個種子作為生長種子，在種子周圍搜索符合約束條件的種子，將其合并到種子點像素的集合.不斷重復上述過程，直到?jīng)]有符合約束條件的像素[13-14].其中約束條件是式8：

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(1) 梯度比Gr值測定。排水管淤塞試驗在梯度比滲透儀上進行，其原理是通過測定滲透24 h后土工織物及其上25 mm厚土層的水力梯度i1以及土工織物上部25 mm至75 mm這段土層的水力梯度i2，按照下式求出梯度比Gr值：

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纖維素酶活力單位：在37℃，pH值5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。

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