miR-381在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

梁穎瑩，莫志文，黃宇帆，邵汛帆，袁亞維

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州510030)

腎細(xì)胞癌(腎癌)是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。腎癌治療方法包括手術(shù)及免疫治療，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是威脅患者生命的重要原因，進(jìn)展期患者5年生存率不到10%[2]。因此，深入研究腎癌發(fā)病機(jī)制，對提高腎癌診治水平具有重要意義。miRNA不編碼蛋白質(zhì)，可通過與靶標(biāo)基因3′-UTR端的序列結(jié)合從而沉默基因表達(dá)[3]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中miRNA表達(dá)異常，且miRNA可通過影響細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。研究[5,6]認(rèn)為miRNA可作為多種腫瘤的臨床診斷、病理分型和預(yù)后的標(biāo)志物。miR-381位于人14號染色體上，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，對腫瘤細(xì)胞的生長侵襲有抑制作用。有學(xué)者[7～9]報道m(xù)iR-381可通過抑制ERK和AKT信號通路促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，其表達(dá)水平也與肺癌的預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)。關(guān)于miR-381在腎癌中的作用尚未見報道。本研究觀察了miR-381在腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)變化，及其對腎癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 腎癌細(xì)胞系Caki-2、A498、786-O及人正常腎上皮細(xì)胞系HK-2均購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心細(xì)胞庫。胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Roswell公司。DNA結(jié)合抑制因子1(ID-1)及GAPDH一抗均購自美國BD公司，二抗購自美國Santa Cruz公司。miR-381 mimics及Scramble均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。RT-PCR儀購自美國BD公司。HBS-1096B酶標(biāo)儀購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。蛋白免疫印跡電泳設(shè)備購自美國Bio-Rad公司。

1.2 腎癌細(xì)胞中miR-381檢測 Caki-2、A498、786-O細(xì)胞及HK-2細(xì)胞均種植于RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后消化傳代。采用qRT-PCR法檢測各細(xì)胞中的miR-381，以U6小核RNA作為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示miR-381相對表達(dá)量。

1.3 miR-381表達(dá)變化后細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力觀察

1.3.1 Caki-2細(xì)胞分組及miR-381 mimics轉(zhuǎn)染方法 將Caki-2細(xì)胞分為miR-381組、NC組、mock組，miR-381組采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-381 mimics，mock組轉(zhuǎn)染miR-381 Scramble，NC組不做轉(zhuǎn)染處理。miR-381 mimics上游引物序列為5′-UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU-3′，下游引物序列為5′-AGAGAGCUUGCCCUUGUAUAUU-3′。miR-381 Scramble上游引物序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。采用qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞中的miR-381，miR-381組、NC組、mock組中miR-381相對表達(dá)量分別為8.950±0.720、1.000±0.003、1.090±0.050，miR-381組miR-381相對表達(dá)量高于mock組和NC組(P均<0.05)。提示轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將miR-381組、NC組及mock組細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后，以2×103個/孔將種植于96孔板上，每孔培養(yǎng)基體積200 μL，分別于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔光密度值(OD值)，以此表示細(xì)胞增殖能力。以時間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.3 細(xì)胞遷移能力檢測 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將miR-381組、NC組、mock組細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后用胰蛋白酶消化，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)板后，用200 μL的Tips槍頭沿培養(yǎng)板劃直線，分別于劃痕后即刻和劃痕后48 h計算劃痕面積和劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻劃痕面積-劃痕后48 h劃痕面積)/劃痕后即刻劃痕面積×100%。劃痕愈合率越高，表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。取miR-381組、NC組、mock組2×104個細(xì)胞，接種于碳酸磷脂表面，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，用1%多聚甲醛與膜下面的細(xì)胞結(jié)合，哈里斯蘇木精溶液染色，在高倍鏡(200×)下隨機(jī)取10個視野，計算穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 各組細(xì)胞中ID-1 mRNA及蛋白檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后提取mRNA及蛋白，采用qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞中的ID-1 mRNA。采用Western blotting法檢測各組細(xì)胞中的ID-1蛋白。將miR-381組、NC組、mock組細(xì)胞裂解、變性，每孔30 μg蛋白上樣。濃縮膠條件為50 min、80 V，分離膠條件為100 min、100 V，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，加入ID-1及GAPDH一抗，濃度為1∶200，4 ℃孵育過夜，加入二抗37 ℃孵育4 h，PBST漂洗后ECL液顯影。采用Quantity One 1-D軟件分析條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 腎癌細(xì)胞中miR-381表達(dá)變化 Caki-2、A498、786-O細(xì)胞中miR-381相對表達(dá)量分別為0.290±0.030、0.370±0.040、0.51±0.043，HK-2細(xì)胞中miR-381相對表達(dá)量為1.00±0.04。Caki-2、A498、786-O細(xì)胞中miR-381相對表達(dá)量低于HK-2細(xì)胞(P均<0.01)。

2.2 各組Caki-2細(xì)胞增殖能力比較 轉(zhuǎn)染72、96 h后miR-381組細(xì)胞增殖能力低于NC組、mock組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后不同時間三組Caki-2細(xì)胞OD值比較

2.3 各組Caki-2細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 miR-381組、mock組、NC組細(xì)胞劃痕愈合率分別為28.7%±2.6%、59.7%±4.8%、56.4%±4.5%，侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(44.7±3.9)、(235.9±17.9)、(225.7±15.7)個，miR-381組細(xì)胞劃痕愈合率及侵襲細(xì)胞數(shù)均少于mock組、NC組(P均<0.01)。詳見圖1A、圖1B。

注：A為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B為Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1各組細(xì)胞遷移、侵襲能力情況

2.4 各組Caki-2細(xì)胞中ID-1 mRNA及蛋白表達(dá)比較 miR-381組、mock組、NC組細(xì)胞中ID-1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.38±0.04、1.08±0.09、1.0±0.06，ID-1蛋白相對表達(dá)量分別為0.45±0.04、1.11± 0.08、1.0±0.09，miR-381組細(xì)胞中ID-1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均低于mock組、NC組(P均<0.01)。

3. 討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占泌尿系統(tǒng)腫瘤的第二位[1]。腎癌目前常用的治療方法包括手術(shù)和放化療，但療效不理想，因此，尋找合適的早期生物標(biāo)志物成為研究重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)多個miRNA異常表達(dá)(如miR-34a，miR-141、miR-142-3p、miR-21、miR-155、miR-210)對腎癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展起重要調(diào)控作用[10～12]。

miR-381的編碼序列位于14號染色體上，已證實(shí)與細(xì)胞增殖、分化有關(guān)。在腦腫瘤中，miR-381可作為重要的血清診斷標(biāo)志物及預(yù)后標(biāo)志物。此外，miR-381可以通過抑制C/EBP依賴性的CX43表達(dá)而參與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，通過調(diào)控p53/PTTG1通路從而促進(jìn)垂體腫瘤發(fā)生，并可通過抑制SOX4促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[8，12]。陳兵海等[7]報道，在腎細(xì)胞癌中miR-381呈顯著低表達(dá)。本研究選取三個腎細(xì)胞癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)相對于人正常腎上皮細(xì)胞系HK-2，Caki-2、A498、786-O細(xì)胞中miR-381相對表達(dá)量降低，與上述研究結(jié)果一致。為研究miR-381在腎癌發(fā)生發(fā)展中的作用，我們上調(diào)了Caki-2細(xì)胞中miR-381的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染72、96 h后miR-381組細(xì)胞增殖能力低于NC組、mock組，miR-381組細(xì)胞劃痕愈合率及侵襲細(xì)胞數(shù)均少于mock組、NC組。這說明miR-381過表達(dá)后，Caki-2細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，推測miR-381起到了抑癌基因作用。

研究[13]發(fā)現(xiàn)，miR-381可靶向結(jié)合ID-1，并確認(rèn)ID-1為miR-381的靶標(biāo)分子。ID家族成員的3′非編碼區(qū)可能存在一個能夠與miR-381相結(jié)合的區(qū)域，提示異常高表達(dá)的miR-381可能通過對ID的靶向調(diào)控從而參與早期癌變過程。ID-1是螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，其表達(dá)一旦失調(diào)，會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[14]。ID-1主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞分化，誘導(dǎo)血管形成，與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)[15]。目前研究認(rèn)為，ID-1主要是通過調(diào)控細(xì)胞周期來影響細(xì)胞增殖、分化的。在正常組織中，ID-1蛋白表達(dá)水平較低甚至不表達(dá)；而在惡性腫瘤中，如前列腺癌、膀胱癌、食道癌等組織中均可檢測到ID-1高表達(dá)[16～18]。故有學(xué)者[18～20]認(rèn)為ID-1是腫瘤診斷及預(yù)后標(biāo)志物。為探討miR-381參與腎癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測了三組細(xì)胞中的ID-1 mRNA及蛋白，結(jié)果顯示，miR-381組細(xì)胞中ID-1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均低于mock組、NC組，提示miR-381能夠通過作用于ID-1來發(fā)揮抑癌作用，抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。

綜上所述，腎癌細(xì)胞中miR-381呈低表達(dá)；過表達(dá)miR-381可降低腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，其機(jī)制可能與ID-1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。miR-381參與了腎癌細(xì)胞的增殖調(diào)控，可能成為腎癌新的治療靶點(diǎn)。然而，本研究是在體外細(xì)胞系中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究，至于在動物實(shí)驗(yàn)中結(jié)果如何以及miR-381在體內(nèi)組織中的表達(dá)與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，都需要進(jìn)一步研究。

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