加味四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型大鼠AQP-1、VEGF、COX-2表達(dá)的影響

李瑞芝 馬浩清 金曉董 陳大貴

（1.海寧市中醫(yī)院，浙江海寧314400； 2.海寧衛(wèi)生學(xué)校藥學(xué)教研室，浙江海寧314400；3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200433）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)是第4位最常見的癌癥和致死因素[1]。加味四君子湯是在四君子湯（黨參、白術(shù)、茯苓、甘草）的基礎(chǔ)上加入了薏苡仁、藤梨根、白花蛇舌草、石見穿、大血藤等藥物，能益氣健脾、扶正祛邪，近年來在腫瘤防治方面應(yīng)用廣泛，尤其是在腫瘤晚期正氣虧虛之時(shí)，是扶正祛邪的常用良方。研究表明，四君子湯能有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，薏苡仁、白花蛇舌草、藤梨根等藥物也具有一定的抗腫瘤效果[2-5]。本院臨床上將該方應(yīng)用于結(jié)腸癌治療，療效確切，但尚缺乏對(duì)該方抗結(jié)腸癌作用機(jī)制的系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)以二甲肼（1-2dimethylhydrazine，DMH）皮下注射加2%葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）水溶液飲用誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生結(jié)腸癌，研究加味四君子湯對(duì)結(jié)腸癌模型大鼠環(huán)氧化酶-2（COX-2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和水通道蛋白（AQP-1）的影響，探討中藥治療機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，60只，雌雄各半，160～180g，6周齡，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥物、試劑與儀器 加味四君子湯（海寧市中醫(yī)院制備），按配方稱取藥材黨參20g、薏苡仁30g、白術(shù)15g、藤梨根30g、茯苓15g、石見穿30g、白花蛇舌草30g、大血藤30g、蜜甘草10g，加入10倍量的蒸餾水煎煮60min，過濾，取濾液，減壓蒸餾濃縮制得水提物，保存?zhèn)溆谩｛}酸小檗堿片，上海信誼藥業(yè)有限公司，批號(hào)22140712。DMH，上海星黍生物科技有限公司；DSS，上海生工生物；AQP-1、COX-2和VEGF酶標(biāo)免疫試劑盒，上海星黍生物科技有限公司。JA2203A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡及顯微攝像系統(tǒng)，OLYMPUS公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices，型號(hào)SpectraMax M5。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，依據(jù)體重隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥物組和加味四君子湯低、中、高劑量組，每組10只。

2.2 造模與給藥 參照文獻(xiàn)[6]，利用DMH加DSS誘導(dǎo)，預(yù)實(shí)驗(yàn)造模成功。造模開始第1周除正常組外所有大鼠給予DMH 40mg/kg頸部皮下注射，隔日1次，共3次；第2周給予除正常組外所有大鼠自由飲用2%DSS水溶液；第3、4周所有大鼠自由飲用自來水和攝食普通飼料。從第4周末開始，加味四君子湯低、中、高劑量組分別予中藥10、20、40g/kg，1mL/100g大鼠體重灌胃；陽性藥物組予鹽酸小檗堿90mg/kg，1mL/100g大鼠體重灌胃。各給藥組分別給藥4周。

2.3 觀察指標(biāo) 每日上、下午分別觀察1次各組大鼠的一般情況，如毛色、食量、大便性狀、精神活動(dòng)情況等，每周稱量1次體重并記錄。于實(shí)驗(yàn)第8周，各組大鼠用10%水合氯醛生理鹽水溶液（0.3mL/100g大鼠體重）腹腔麻醉，取血清和直腸組織，ELISA試劑盒檢測(cè)外周血中AQP-1、COX-2和VEGF含量，免疫組化檢測(cè)結(jié)腸癌組織中COX-2和VEGF的表達(dá)，各組織切片采用HE染色法進(jìn)行染色。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果以（±s）表示，用ANVOA方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠一般情況 造模第3周，部分造模大鼠出現(xiàn)腹股溝潰瘍，活動(dòng)明顯減少，攝食和飲水量下降，皮毛不潔黯淡。給藥第2周后，各給藥組大鼠腹股溝潰瘍開始逐漸痊愈，攝食和飲水有所好轉(zhuǎn)，精神狀態(tài)依然不佳。給藥第4周，部分大鼠出現(xiàn)肛周潰瘍伴有稀便和便血。加味四君子湯低、中、高劑量組和陽性藥物組大鼠上述癥狀輕于模型組。

3.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體重變化情況 造模3周開始，模型組大鼠體重明顯低于正常組（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組能夠不同程度地改善結(jié)腸癌引起的大鼠體重增長(zhǎng)過慢（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

3.3 各組大鼠干預(yù)后血清COX-2、VEGF、AQP-1含量比較 結(jié)果見表2。模型組大鼠血清COX-2、VEGF、AQP-1含量均顯著高于正常組（P＜0.01），各給藥組COX-2含量明顯低于模型組（P＜0.05），陽性藥物組VEGF含量較模型組顯著降低（P＜0.01），加味四君子湯中、高劑量組VEGF和AQP-1含量明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。加味四君子湯中、高劑量組COX-2和AQP-1含量與陽性藥物組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），VEGF含量明顯高于陽性藥物組（P＜0.05）。加味四君子湯各劑量組之間各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果初步表明加味四君子湯的治療作用可能與降低血清COX-2、VEGF和AQP-1含量有關(guān)。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)各時(shí)期體重比較（±s） g

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)各時(shí)期體重比較（±s） g

注： 與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性藥物組比較，△P＜0.05。

體重造模前　　造模1周　　造模2周　　造模3周　　造模4周正常組　10　167.40±7.65　248.70±18.81　289.90±28.86　354.50±31.03　384.00±29.47模型組　10　168.30±9.62　217.50±18.52　265.30±31.81　317.30±36.22#338.30±33.85##陽性藥物組　10　167.50±9.88　218.30±14.32　266.40±12.03　315.50±17.84　339.10±22.17加味四君子湯低劑量　10　166.10±7.85　218.20±11.59　263.20±18.00　308.70±15.61 333.70±18.68加味四君子湯中劑量　10　167.80±4.89　217.90±14.60　263.10±16.66　311.10±18.21　334.00±16.52加味四君子湯高劑量　10　165.90±7.98　219.60±12.21　268.50±17.90　312.20±23.03　334.30±22.34組別　　動(dòng)物數(shù)（只）組別　　動(dòng)物數(shù)（只）體重給藥1周　　給藥2周　　給藥3周　　給藥4周正常組　10　412.20±31.35　433.80±31.70　452.20±31.73　467.00±34.01模型組　10　347.60±46.57##　356.70±46.33##　367.60±52.49##　372.60±18.75##陽性藥物組　10　374.40±26.81　401.20±28.41*　411.70±26.81*　432.20±35.06**加味四君子湯低劑量　10　363.10±23.03　381.60±29.88△　399.50±34.90　412.20±31.23**△加味四君子湯中劑量　10　365.20±20.44　380.60±20.66△　400.80±22.42　417.90±24.61**△加味四君子湯高劑量　10　369.90±34.47　394.30±32.70*　414.90±34.86*　432.10±37.51**

表2 各組大鼠血清COX-2、VEGF和AQP-1含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清COX-2、VEGF和AQP-1含量比較（±s）

注： 與正常組比較，##P＜0.01 ；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與陽性藥物組比較，△P＜0.05。

組別　　動(dòng)物數(shù)（只）　　劑量　COX-2（ng/L）　VEGF（μg/L）　AQP-1（pg/mL）正常組　10　62.50±3.60　127.52±19.11　2.58±0.17模型組　10　82.51±5.76##　165.25±11.79##　3.94±0.15##陽性藥物組　10　90mg/kg　70.39±9.76*　125.85±22.12**　2.97±0.32加味四君子湯低劑量　10　10g/kg　76.47±6.15*　146.48±20.22　3.23±0.34加味四君子湯中劑量　10　20g/kg　70.87±7.53*　141.22±21.17*△　3.01±0.37*加味四君子湯高劑量　10　40g/kg　68.13±13.20*　138.16±15.41**△　2.99±0.34**

3.4 各組大鼠結(jié)腸癌組織中COX-2和VEGF表達(dá)比較 模型組大鼠腫瘤組織中COX-2、VEGF均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而各給藥組陽性表達(dá)均有不同程度降低，見圖1、圖2。

4 討論

結(jié)腸癌全身癥狀主要為腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱，局部癥狀有肛門內(nèi)脹熱灼痛、便意頻繁、糞便混有黏液及血絲、里急后重、排尿不暢、尿頻，由于其發(fā)病周期長(zhǎng)，給患者、家庭及社會(huì)造成很大負(fù)擔(dān)[7]。

DMH誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌變是一個(gè)長(zhǎng)期、多因素共同參與的過程，其引起的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及組織病理學(xué)變化和腫瘤形成的分子機(jī)制等均與人類的結(jié)腸癌形成過程相似，是研究結(jié)腸癌形成的良好模型[8]。因此，我們采用改良的DMH+DSS方法誘導(dǎo)大鼠形成結(jié)腸癌模型。AQP-1屬于小分子疏水性內(nèi)在膜蛋白家族，其主要

表達(dá)于膽管、膽囊、腎臟、胎盤、大腦和脈絡(luò)叢等組織器官中[9]。Moon C等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸和直腸腫瘤形成的早期階段AQP-1即可被誘導(dǎo)表達(dá)。AQP-1與腫瘤

的血管發(fā)生與轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，具體表現(xiàn)為對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移具有促進(jìn)作用，促進(jìn)腫瘤血管生成，同時(shí)增強(qiáng)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。與野生型小鼠相比，AQP-1基因敲除小鼠體內(nèi)植入腫瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢，因此可利用藥物抑制AQP-1介導(dǎo)的快速水轉(zhuǎn)運(yùn)，使內(nèi)皮細(xì)胞因在遷移過程中缺乏局部跨膜離子流而不能形成細(xì)胞膜突出，減慢細(xì)胞遷移速率[11]。上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞分泌的各種炎性因子在腸腫瘤形成的過程中起到了關(guān)鍵作用，而COX-2在炎癥發(fā)生過程中起到重要作用。它作為一種誘導(dǎo)型酶，在正常組織不表達(dá)，可由促炎性因子、生長(zhǎng)因子、癌基因等誘導(dǎo)表達(dá)。Oshima等[12]發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比，COX-2基因敲除的APCdelta716小鼠腺癌的數(shù)量和大小明顯改善，因此抑制COX-2可有效預(yù)防結(jié)腸癌。另有研究表明，VEGF主要參與了新生血管和淋巴管的形成，其中新生血管有助于腫瘤生成，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。VEGF在結(jié)直腸癌中高表達(dá)與腫瘤的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有正相關(guān)性，是結(jié)腸癌診斷以及預(yù)后估計(jì)的重要指標(biāo)[13]。

圖1 各組大鼠結(jié)腸癌組織中COX-2表達(dá)比較（×200）

圖2 各組大鼠大鼠結(jié)腸癌組織中VEGF表達(dá)比較（×200）

本研究結(jié)果表明，加味四君子湯可降低結(jié)腸癌模型大鼠COX-2、VEGF和AQP-1含量，這可能是其治療結(jié)腸癌的作用機(jī)制。日本學(xué)者Soumaoro LT[14]在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)COX-2、VEGF呈正相關(guān)性，兩者與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。本研究為加味四君子湯對(duì)結(jié)腸癌的治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，關(guān)于加味四君子湯對(duì)結(jié)腸癌治療作用的其他相關(guān)機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

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