王 麗 李 強(qiáng) 楊莉莉 李俊毅 邵海峰
(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心血管一科,齊齊哈爾 161000)
近年來,以糖尿病為主的代謝綜合征成為影響人類健康的主要慢性疾病之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),預(yù)計(jì)到2030年全球糖尿病患者將達(dá)到4.5億左右,其中糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)的人數(shù)也相當(dāng)可觀[1,2]。糖尿病心肌病是指糖尿病患者在無其他因素引起心臟異常的情況下出現(xiàn)的心臟能量代謝或結(jié)構(gòu)異常的一類疾病,其病理特征主要為心肌肥大、局灶性壞死和纖維化、小動脈內(nèi)膜增厚等,發(fā)病率和死亡率在糖尿病心臟并發(fā)癥中位于第二位[3]。心肌細(xì)胞的增殖、凋亡廣泛參與DCM等心腦血管疾病的病理生理過程[4-6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵信號因子、參與蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的結(jié)構(gòu)蛋白[7]。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾XBP1的表達(dá),探討XBP1對高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響和作用機(jī)制,以期為DCM的治療和診斷提供理論依據(jù)。
1.1實(shí)驗(yàn)材料 H9C2心肌細(xì)胞由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Fatal bovine serum,F(xiàn)BS)均購自美國Gibco公司,XBP1 siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并鑒定,轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)購自美國Invitrogen公司,CCK-8檢測試劑盒、Annexin V/PI試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國公司Santa Cruz等。
1.2方法
1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 細(xì)胞培養(yǎng):心肌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中,加入10%的FCS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素,置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合度為70%~90%時(shí)使用0.25%的胰酶消化傳代培養(yǎng),取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
細(xì)胞處理:取對數(shù)期的細(xì)胞,胰酶消化成單細(xì)胞懸液,接種于六孔板上,每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞,待細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí),離心,棄去培養(yǎng)基,PBS緩沖液清洗,每孔加入10 μl脂質(zhì)體Lipofectamine 2000,細(xì)胞中分別加入siRNA-XBP1(siRNA-XBP1組)、siRNA-NC(對照組),以β-actin為內(nèi)參,蛋白免疫印跡(Western blot)檢測XBP1蛋白的相對表達(dá)量。
高糖干預(yù)實(shí)驗(yàn)分為4組:低糖對照組(使用5.5 mmol/L 葡萄糖作用于細(xì)胞,LG組)、高糖刺激組(使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細(xì)胞,HG組)、高糖加siRNA-NC(使用XBP1 siRNA-NC預(yù)處理細(xì)胞24 h,使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細(xì)胞,HG+NC組)、高糖加XBP1-siRNA組(使用XBP1 siRNA預(yù)處理細(xì)胞24 h,使用33.3 mmol/L葡萄糖作用于細(xì)胞,HG+siRNA),各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。
1.2.2CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況 收集對數(shù)期細(xì)胞,每孔加入100 μl培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/孔,37℃、5%CO2孵育48 h,至細(xì)胞單層鋪滿孔底,每組5個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μl CCK-8溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h,在450 nm測定吸光值(OD值),試驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算細(xì)胞存活率。
1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 胰酶處理細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),離心,PBS緩沖液重懸細(xì)胞密度為(5~10)×105個(gè)/ml,取1 ml細(xì)胞置于新的離心管中,加入5 μl膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V)-FITC混合液和10 μl碘化丙啶(PI)染色液,輕輕振動混勻,避光,置于流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測。
1.2.4Western blot 檢測細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達(dá) 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí),PBS緩沖液清洗細(xì)胞,離心,取上清,加入預(yù)冷的5 μl磷酸酶抑制劑、5 μl PMSF、1 μl蛋白酶抑制劑,靜置30 min,15 000 r/min離心10 min,上清即為蛋白提取物,BCA法進(jìn)行蛋白定量。配置10%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,按照纖維墊-濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-濾紙-纖維墊的順序安裝轉(zhuǎn)印夾層,進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,將硝酸纖維素膜置于5%脫脂奶粉封閉液中,室溫下振蕩2 h。加入一抗反應(yīng)液,4℃孵育過夜,TBST洗膜液清洗3次,每次10 min;加入二抗,室溫振蕩2 h,TBST洗膜液清洗3次,每次10 min,反應(yīng)結(jié)束后加入ECL化學(xué)發(fā)光顯色,室溫反應(yīng)1 min,暗室中曝光1~2 min,分別浸入顯影液和定影液中30 s,試驗(yàn)重復(fù)3次,使用Quantity One 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,蛋白的相對含量為目的蛋白OD值/β-actin OD值。
2.1Western blot檢測XBP1蛋白的表達(dá)量 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中XBP1 蛋白的表達(dá)量,結(jié)果如圖1、表1所示,對照組和siRNA-XBP1組細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量分別為(0.859±0.091)、(0.283±0.059)。與對照組相比,siRNA-XBP1組細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量明顯下降(t=9.199,P<0.05),說明XBP1 siRNA能夠有效降低XBP1的表達(dá)。
2.2CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況 各組細(xì)胞的增殖情況如表2所示,LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的存活率分別為(100.25±10.036)%、(60.413±7.526)%、 (62.891±7.796)%、 (80.107±6.058)%;與LG組相比, HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的存活率均顯著降低(t1=5.500,P1=0.005,t2=5.092,P2=0.007,t3=2.976,P3=0.041);與HG組相比,HG+NC組細(xì)胞的存活率無顯著差異(t=0.396,P=0.712),但HG+siRNA組細(xì)胞的存活率明顯升高(t=3.531,P=0.024)。
2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況 各組細(xì)胞的凋亡情況如圖2、表3所示,LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的凋亡率分別為(9.963±1.534)%、(48.563±5.398)%、(46.279±6.243)%、(20.489±3.421)%;與LG組相比,HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高(t1=11.914,P1=0.000,t2=9.784,P2=0.001,t3=4.863,P3=0.008);與HG組相比,HG+NC組細(xì)胞的凋亡率無顯著差異(t=0.479,P=0.657),但HG+siRNA組細(xì)胞的凋亡率明顯降低(t=7.609,P=0.002)。
2.4Western blot 檢測細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達(dá) 結(jié)果如表4、圖3所示,LG組、HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量分別為(0.246±0.051)、(0.859±0.047)、(0.843±0.086)、(0.423±0.072);C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表達(dá)量分別為(0.195±0.056)、(0.762±0.083)、(0.724±0.060)、(0.480±0.061);p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(p53 upregulated modulator of apoptosis,Puma)的表達(dá)量分別為(0.153±0.025)、(0.642±0.051)、(0.651±0.073)、(0.450±0.058);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白的表達(dá)量分別為(0.134±0.042)、(0.601±0.013)、(0.620±0.042)、(0.306±0.060)。與LG組相比,HG組、HG+NC組、HG+siRNA組細(xì)胞中XBP1(t1=15.309,P1=0.000,t2=10.342,P2=0.001,t3=3.475,P3=0.026)、CHOP(t1=9.809,P1=0.001,t2=11.164,P2=0.000,t3=5.961,P3=0.004)、Puma(t1=14.912,P1=0.000,t2=11.179,P2=0.000,t3=8.145,P3=0.001)、Caspase-3(t1=18.398,P1=0.000,t2=14.172,P2=0.000,t3=4.068,P3=0.015) 的表達(dá)量均顯著增加;與HG組相比,HG+NC組細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的表達(dá)量沒有明顯變化(t1=0.282,P1=0.791,t2=0.643,P2=0.555,t3=0.175,P3=0.870,t4=0.749,P4=0.796),但HG+siRNA組細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的表達(dá)量顯著降低(t1=8.783,P1=0.001,t2=4.742,P2=0.009,t3=4.306,P3=0.013,t4=8.323,P4=0.001)。
圖1 siRNA干擾細(xì)胞中XBP1蛋白的表達(dá)量Fig.1 Expression of XBP1 protein in siRNA interfe-ring cells
GroupsExpressionofXBP1proteinControlgroup0.859±0.091siRNA-XBP1group0.283±0.0591)
Note:Compared with the control group,1)P<0.05.
表2XBP1siRNA對高糖處理的心肌細(xì)胞存活率的影響
GroupsSurvivalrate(%)LGgroup100.25±10.036HGgroup60.413±7.5261)HG+NCgroup62.891±7.7961)HG+siRNAgroup80.107±6.0581)2)
Note:Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.
GroupsRateofapoptosis(%)LGgroup9.963±1.534HGgroup48.563±5.3981)HG+NCgroup46.279±6.2431)HG+siRNAgroup20.489±3.4211)2)
Note:Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.
GroupsXBP1CHOPPumaCaspase-3LGgroup0.246±0.0510.195±0.0560.153±0.0250.134±0.042HGgroup0.859±0.0471)0.762±0.0831)0.642±0.0511)0.601±0.0131)HG+NCgroup0.843±0.0861)0.724±0.0601)0.651±0.0731)0.620±0.0421)HG+siRNAgroup0.423±0.0721)2)0.480±0.0611)2)0.450±0.0581)2)0.306±0.0601)2)
Note:Compared with the LG group,1)P<0.05;compared with the HG group,2)P<0.05.
圖3 心肌細(xì)胞XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of XBP1,CHOP,Puma and Caspase-3 proteins in cardiomyocytes
糖尿病心肌病已被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的、特異的心肌疾病。在糖尿病各種并發(fā)癥中,細(xì)胞的增殖、凋亡異常將導(dǎo)致心功能嚴(yán)重受損[8]。高血糖癥是誘發(fā)糖尿病并發(fā)心血管疾病的重要因素之一。有研究表明,67.1%的糖尿病并發(fā)心血管患者均伴有血脂異常[9]。因此有必要研究高糖狀態(tài)下心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)和未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)是細(xì)胞內(nèi)重要的凋亡信號通路[10]。XBP1是ERS的重要調(diào)節(jié)因子,當(dāng)受到應(yīng)激時(shí)即被活化,激活多條信號通路發(fā)揮作用[11]。文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí),激活UPR信號通路,從而使XBP1被活化轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,調(diào)控UPR下游靶基因及多種信號因子的表達(dá),調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展[12]。研究表明下調(diào)XBP1的表達(dá)量會導(dǎo)致相關(guān)下游靶基因的表達(dá)量降低,參與新血管生成、能量代謝、細(xì)胞的增殖和凋亡等過程[13]。在DCM的病程中,高血糖、氧化應(yīng)激等因素均可誘發(fā)ERS和UPR,從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的增殖受到抑制,凋亡率增加。然而在這一過程中,XBP1對心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少。所以本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾XBP1在高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞的表達(dá)量,觀察其表達(dá)量對心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示siRNA-XBP1可降低心肌細(xì)胞中XBP1的表達(dá)量;高糖環(huán)境可抑制細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,但XBP1的表達(dá)量降低可緩解高糖促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。
CHOP也稱為GADD153,是ERS調(diào)控的凋亡信號通路中的關(guān)鍵因子之一,當(dāng)發(fā)生ERS反應(yīng)時(shí),受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,表達(dá)水平增加,從而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞α-細(xì)辛醚處理細(xì)胞時(shí)可激活ERS,調(diào)節(jié)ERS下游靶基因CHOP的表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道在心肌細(xì)胞中,CHOP的表達(dá)量升高激活心肌細(xì)胞凋亡途徑抑制其增殖[15]。Puma是促凋亡基因,對細(xì)胞凋亡、增殖起重要作用。有研究表明,Puma為CHOP下游靶基因,發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[16]。在線粒體內(nèi)膜上,Puma與Bcl-2或者Bax結(jié)合,增強(qiáng)線粒體膜的通透性,釋放細(xì)胞因子,誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究證明,丙烯醛可提高Puma的表達(dá)量,裂解Bid,從而誘導(dǎo)Caspase-3的活化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一,是細(xì)胞凋亡過程中的剪切酶。
Caspase-3可通過與底物結(jié)合,降解下游底物,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究報(bào)道當(dāng)機(jī)體受到異常刺激時(shí),通過升高Caspase-3的表達(dá)量,從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖[18-20]。本實(shí)驗(yàn)檢測了siRNA干預(yù)XBP1和高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3的含量,發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可使XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白表達(dá)量升高,但XBP1表達(dá)量降低可抑制高糖促進(jìn)XBP1、CHOP、Puma、Caspase-3蛋白表達(dá)量升高,且CHOP、Puma的表達(dá)量隨著XBP1的降低而降低,表明高糖環(huán)境下,激活ERS,但XBP1表達(dá)量降低可降低高糖激活ERS的作用,其作用機(jī)制是通過調(diào)控XBP1/CHOP/Puma信號通路從而促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡。
總之,RNA干擾XBP1的表達(dá)可抑制高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)其增殖,防止糖尿病心肌病的惡化,其作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)XBP1/CHOP/Puma信號通路發(fā)揮作用。
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當(dāng)然,女貪官腐敗還有諸多其他動機(jī),例如僥幸心理、補(bǔ)償心理、攀比心理等。筆者認(rèn)為,僥幸心理只是上述投機(jī)心理的別樣稱呼,基于不平衡心理而生的補(bǔ)償心理只是一種自我報(bào)償心理,仍不出“報(bào)償”的范疇,而攀比心理看似 “趨寡”實(shí)為“追風(fēng)”,只是對“從眾”的表面偏離,仍屬從眾心理的范疇,故于此不再論述。
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