微孔濾膜在實驗室研究與分析檢測中的應用

張俊偉，鄒凱倫

(杭州安諾過濾器材有限公司，浙江 杭州 311404)

微孔濾膜分離技術是一種壓力驅動型膜分離技術，其核心組件是采用高分子有機材料(如聚醚砜，聚四氟乙烯，聚偏二氟乙烯等)或無機材料(陶瓷，玻璃纖維，金屬等)制備的微孔濾膜。流體(液體和氣體)，在過濾上下游壓差力的作用下，經過微孔濾膜的過濾，流體中粒徑大于膜孔徑(通常為0.03-100 μm)的微粒會被微孔濾膜截留或吸附，下游則得到了較純凈的流體，從而達到了固液分離和固氣分離的效果[1]。從世界范圍來看，普通如家庭生活、大型如工業(yè)生產、高端如科學研究，都在不同程度上應用微孔濾濾膜分離技術。微孔濾膜和以其為核心材料制成的濾器在應用端主要性能表現(xiàn)在以下方面：①截留率；②納污量；③化學性兼容性；④表面濕潤程度；⑤使用溫度范圍；⑥機械強度；⑦可清洗性；⑧吸附性等。早在二戰(zhàn)期間，德國就開始嘗試用孔徑約0.5μm的微孔濾膜檢測城市給水系統(tǒng)中的大腸桿菌。戰(zhàn)后，美、英等國深入開展了濾膜技術的研究，并于1947年起各自相繼成立了濾膜的工業(yè)生產和研究機構，其中包括了一些世界著名的微孔膜和濾器生產型企業(yè)，如Merk Millipore，Pall，3M等。近十幾年來，隨著各類型微孔濾膜和以其為核心材料制成的濾器的研制成功和應用開發(fā)，該項類型產品及相關技術不僅在世界各國科研，各工業(yè)生產領域和民用領域中得到較廣泛的應用，而且也已經應用到實驗室研究和分析檢測領域中，具體應用點包括了：色譜分析、液體澄清/除菌/除病毒過濾、無菌通氣、微生物檢測和計數(shù)、蛋白和核酸檢測、環(huán)境空氣細顆粒物(PM2.5)監(jiān)測和醫(yī)療診斷試紙等。接下來，本文就微孔濾膜在國內外實驗室研究和分析檢測領域的應用進行較為詳細的綜述。

1 微孔濾膜在色譜分析中的應用

微孔濾膜及濾器在化學分析研究中具有十分廣泛的應用。分析儀器諸如高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、凝膠色譜(GPC)、離子色譜(IC)以及電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)等在制樣時均需使用相關微濾產品去除樣品中的顆粒雜質，防止管路、泵或分離柱等關鍵零部件的堵塞或損傷，延長整機的使用壽命的同時并保證分析結果的準確性。

以HPLC為例，其進樣前需要使用0.22 μm或0.45 μm的針式過濾器，配合針筒手工推注過濾樣品，去除不溶性的顆粒物。HPLC的流動相在使用前也需要用0.22 μm或0.45 μm微孔濾膜配合玻璃抽濾瓶進行真空抽濾去除顆粒，或者也可在HPLC上安裝在線過濾/脫氣裝置，微孔濾膜對流動相過濾去除顆粒的同時還可以脫除分散其中的微小氣泡，減少基線波動[2]。

2 微孔濾膜在液體澄清/除菌/除支原體過濾中的應用

在生化實驗操作中，經常需要對各種溶液進行澄清處理。最常用的處理方式就是微孔膜過濾法。對于高顆粒物含量或者高粘度的溶液，為了減少濾材因堵塞而頻繁更換，可以選擇具有高納污量、低阻力的超細玻璃纖維濾紙進行過濾，但需要注意的是下游可能會有纖維脫落。對于尺寸較小的細微顆粒(0.1～1.0 μm)，則需要采用精度更高的微濾膜來實現(xiàn)去除。使用的過程中，應依據(jù)溶液的特性(pH、極性、溶度參數(shù)、溫度等)，選擇合適材質的進行過濾。在經高壓蒸汽滅菌、γ輻照或EO熏蒸等方式滅菌后，微孔濾膜及濾器可被用于溶液的除菌過濾，特別是一些含有溫敏性物質而無法采用高溫蒸汽滅菌的溶液。因而這種除菌方式又被成為“冷除菌”。生化實驗中常見的培養(yǎng)基、緩沖液、血清、蛋白溶液等都可以采用微孔濾器進行除菌。能夠通過107CFU/cm2缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta,ATCC 19146)挑戰(zhàn)水平測試的微孔過濾器被認為是“除菌級”，其孔徑等級被定義為0.22 μm或0.2 μm[3-4]。此外，0.1 μm孔徑等級的微孔濾膜被認為是可以在一定程度上除支原體。美國Merck millipore公司和美國Pall公司均先后推出了商品化的0.1 μm除支原體過濾器[5]，但這些產品都是基于自己的公司的產品標準。目前國際上除支原體過濾器的測試標準尚屬空白。上述的應用信息匯總見表1。

表1 液體澄清/除菌/除支原體過濾應用性能匯總Table 1 Application performance summary of liquidclarification / sterilization / mycoplasma removal filters

3 微孔濾膜在無菌通氣(氣體無菌過濾)過程中的應用

0.22 μm孔徑等級的疏水聚四氟乙烯(PTFE)和疏水聚偏二氟乙烯(PVDF)微孔濾膜因其自身天然的強疏水性和良好的阻菌性能，被廣泛用于無菌通氣，如實驗室規(guī)模的微生物發(fā)酵、細胞培養(yǎng)、植物無土培養(yǎng)。

微生物好氧發(fā)酵過程中需使用Φ 50 mm 0.22 μm 疏水PTFE微孔濾膜制成的蝶式過濾器進行無菌通氣。PTFE蝶式過濾器讓發(fā)酵時產生代謝氣體從內部經膜孔排出發(fā)酵罐，同時外部空氣經膜孔進入發(fā)酵罐內，而環(huán)境中的雜菌和灰塵則被濾膜阻擋在外，避免發(fā)酵罐內感染雜菌。

PTFE膜也可以應用在細胞培養(yǎng)(懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng))。0.22 μm PTFE微孔濾膜被焊接在細胞培養(yǎng)瓶的瓶蓋上，起到阻菌和換氣的作用。

4 微孔濾膜在微生物檢測和計數(shù)中的應用

在二十世紀六十年代，世界各國已經開始推廣基于微孔濾膜的微生物檢測分析技術[6]。目前，微孔濾膜法是一種國際公認的微生物標準檢驗方法。該方法已經寫入到美國USP、歐洲EP、日本JP和中國藥典2015版中，并得到FDA和EPA等組織的承認，廣泛應用于藥品、食品飲料、化妝品的微生物指標控制和潔凈環(huán)境檢測等領域。微孔濾膜過濾法(又稱薄膜過濾法)是指采用一定孔徑等級的無菌微孔濾膜截留流體里的微生物，然后轉移至合適的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)及菌落計數(shù)。該過程常被應用于微生物限度檢測和無菌檢測。與傳統(tǒng)平皿涂布法相比，薄膜過濾法具有不受樣品體積限制、可洗去抑制物、高靈敏度等優(yōu)點。

用于檢測和計數(shù)的微孔濾膜材質主要有混合纖維素酯(MCE)膜和硝酸纖維素酯(NC)膜。后者較脆，而前者在后者基礎上加入了醋酸纖維素酯(CA)材料，使其具有更好的韌性。膜面上一般會用非抑菌性的油墨印上網格，方便菌落形成后計數(shù)。濾膜孔徑等級包括0.22 μm、0.45 μm、0.65 μm、0.8 μm和1.2 μm幾種。其中0.45 μm應用的最為廣泛，兼顧了對微生物的高截留效率和對液體的快速過濾要求，可用作細菌總數(shù)計數(shù)，微生物復活率可達到90%以上(相比平板涂布法)。0.22 μm相比0.45 μm對微生物的截留濾更高，但流速慢。0.65 μm、0.8 μm和1.2 μm實際孔徑較大，流速快，但截留性能低，不適合細菌總數(shù)計數(shù)，主要用于酵母和霉菌的培養(yǎng)、計數(shù)。關于上述的應用要求，由美國材料與試驗協(xié)會(ASTM)研究制定了一系列標準測試方法，來評判產品是否符合要求，列于表2。

表2 ASTM關于微孔濾膜在微生物檢測和計數(shù)的系列標準Table 2 Series of ASTM standards for microporous filters in microbial detection and counting application

5 微孔濾膜在蛋白和核酸檢測中的應用

20世紀70年代，學者們發(fā)現(xiàn)微孔濾膜可以吸附生物分子(DNA、RNA和蛋白質)，進而逐漸開發(fā)出了Southern Blotting、Northern Blotting、Western Blotting和Eastern Blotting幾種檢測方法。生物分子主要通過疏水作用結合到濾膜上，而微孔濾膜所帶電荷也對生物分子的結合起到一定的作用。常用的轉印膜有硝酸纖維素酯(NC)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和尼龍濾(Nylon)膜。三種濾膜各有其優(yōu)缺點，進行轉印操作時需要根據(jù)實際情況進行選擇。

Western Blotting，又稱蛋白質印跡，是指利用十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳將不同分子量的蛋白質進行分離，并將蛋白質轉印到微孔濾膜上，然后用特定的一抗和二抗與目標蛋白進行特異性結合、顯色，檢測目標蛋白的一種方法。適用于Western Bloting的濾膜主要有NC和PVDF濾膜。NC膜是最早用于Western Blotting的微孔濾膜，其操作簡便，價格便宜，背景低，但是膜本身較脆且容易卷，蛋白結合力略差，且不能重復使用。PVDF轉印膜于1985年推出應用于蛋白質印跡。與NC膜相比，其價格更昂貴，但蛋白結合能力更高，膜的韌性更好，可重復使用[13]。

6 微孔濾膜在環(huán)境空氣細顆粒物(PM2.5)監(jiān)測中的應用

近年來我國環(huán)境污染問題日趨突出，特別秋冬季節(jié)全國范圍內長時間的霧霾污染，對人們的健康、生活和工作造成了嚴重的影響。政府對空氣污染問題空前重視，不斷加大對環(huán)境空氣監(jiān)測活動的投入。

PM2.5指環(huán)境空氣中空氣動力學當量直徑小于等于2.5 μm的顆粒物，也稱細顆粒物。其監(jiān)測方法主要有重量法、β射線法和微量震蕩天平法。這些方法通常需要采用微孔濾膜作為空氣采樣的載體。2013年，中華人民共和國環(huán)境保護部發(fā)布了《HJ 656-2013環(huán)境空氣顆粒物(PM2.5)手工監(jiān)測方法(重量法)技術規(guī)范》，該規(guī)范推薦微孔濾膜材質可選用玻璃纖維濾(GF)膜、石英(Quartz)濾膜等無機濾膜和聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)、混合纖維素酯(MCE)等有機濾膜，要求對0.3 μm標準粒子的截留效率不低于99.7%[14]、采樣后微孔濾膜還可以用于環(huán)境空氣污染顆粒物來源解析工作。該種濾膜的本底值應滿足化學分析要求，化學穩(wěn)定要強，不與沉積物發(fā)生化學反應。在進行解析工作的時候，還需要根據(jù)濾膜本身的特性和采樣后用于化學分析的需求來選擇分析方法[15]。

7 微孔濾膜在醫(yī)療診斷試紙中的應用

微孔濾膜在體外診斷試紙領域有著廣泛的應用，目前應用形式主要為垂直流和側向流兩種，具體應用點包括糖尿病檢測、心臟標志物檢測、腫瘤標志物檢測、妊娠檢測等。我國人口基數(shù)大，農村人口比例多，然而具備高端設備的大型醫(yī)院數(shù)量有限，難以滿足目前的醫(yī)療需求。體外診斷試紙因其快速、高效、廉價等優(yōu)點，非常適合于基層醫(yī)療的檢測要求。

微孔濾膜作為載體膜用于垂直流測試，主要起到固定抗體、抗原、酶等物質的作用，待測樣品由膜的上端流至下端，故稱垂直流。常用膜材為聚醚砜和玻璃纖維材質，厚度一般在100～140 μm，膜標稱孔徑在0.05～0.45 μm之間。

微孔濾膜作為載體膜用于側向流測試，待測樣品由膜的左側經毛細效應流向右側，故稱側向流。常用膜材為硝酸纖維素膜，標稱孔徑為4～10 μm，膜厚度在150～240 μm，NC膜帶正電，對帶負電的蛋白質具有很強的吸附作用，在其上負載抗體或抗原，可以對相應物質進行檢測[16]。

8 微孔濾膜在實驗室研究與分析檢測方面的應用發(fā)展趨勢

微孔濾膜自20世紀初誕生至今經歷了近100年的發(fā)展，膜的品種和規(guī)格不斷豐富和完善，以適應日益細分的行業(yè)應用。未來，由于實驗室分析檢測工作對研究測試高效性和數(shù)據(jù)結果精準性的要求，微孔濾膜產品在該方向的應用發(fā)展趨勢將主要朝著“集成化和自動化”的方向發(fā)展。原本需多環(huán)節(jié)操作實現(xiàn)的功能，將可由一個高度集成的單元一步實現(xiàn)，從而在減少繁瑣的操作流程的同時，還能提高結果的精準性和重復性。微濾產品的設計將更多的符合自動化操作的要求，進而實現(xiàn)大量、快速的操作。

[1] 陳昌駿.微孔濾膜[J].凈水技術，1998(4):31-36.

[2] 孫靜涵.高效液相色譜及樣品前處理技術在藥物和環(huán)境分析中的應用研究[D].重慶:西南大學，2009.

[3] American Society for Testing and Materials. ASTM F838-15a Standard test method for determining bacterial retention of membrane filters utilized for liquid filtration[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2015.

[4] 德國標準化學會(DIN).DIN 58355-3，Membrane Filters - Part 3:Bacteria Challenge Test For Flat Filters - Requirements And Testing[S].[S.l.]:[s.n.],2005.

[5] 張雅會，李少麗，李艷麗.一種去除豬圓環(huán)病毒中支原體污染的方法[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2016(8):42-44.

[6] 劉國良，朱守一.使用微孔濾膜的微生物檢驗技術[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 1975(6):66-69.

[7] American Society for Testing and Materials. ASTM D3862-13，Standard test method for retention characteristics of 0.2-μm membrane filters used in routine filtration procedures for the evaluation of microbiological water quality[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2013.

[8] American Society for Testing and Materials.ASTM D3863-87(2011)，Standard test method for retention characteristics of 0.40 to 0.45-μm membrane filters used in routine filtration procedures for the evaluation of microbiological water quality[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2011.

[9] American Society for Testing and Materials.ASTM D4196-05(2011)，Standard test method for confirming the sterility of membrane filters[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2011.

[10] American Society for Testing and Materials. ASTM D4198-82(2011) Standard test methods for evaluating absorbent pads used with membrane filters for bacteriological analysis and growth[S].West Conshohocken: American Society for Testing and Materials, 2011.

[11] American Society for Testing and Materials .ASTM D 4199-82(2011)，Test methods for Aautoclavability of membrane filters[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2011.

[12] American Society for Testing and Materials. ASTM.D4200-82(2011)，Standard test method for evaluating inhibitory effects of ink grids on membrane filters[S].West Conshohocken: American Society for Testing and Materials,2011.

[13] 李曉軍，秦浚傳，武建國.蛋白印跡技術研究進展[J].臨床檢驗雜志,2004,22(3):227-229.

[14] 中華人民共和國環(huán)境保護部.HJ 656-2013 環(huán)境空氣顆粒物(PM2.5)手工監(jiān)測方法(重量法)技術規(guī)范[S].北京: 中國環(huán)境出版社中國標準出版社,2013.

[15] 中國環(huán)境監(jiān)測總站.環(huán)境空氣顆粒物來源解析監(jiān)測方法指南(試行)(第二版)[OL]. http://www.cnemc.cn/showReport.do?cateId=2092926&contentId=40445&siteId=2002.html,2014.

[16] 馬紅艷，李 強.膠體金診斷試劑盒中層析膜材料性能的分析[J].膜科學與技術，2002，22(6):14-18.