ABL沉默對DOX和TRAIL誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29凋亡的影響

李雨雨, 金由辛, 徐中娟, 張書忙, 索廣力

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444;

2.中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所,江蘇蘇州215123)

Abelson(ABL)家族為非受體酪氨酸激酶(包括ABL1和ABL2),參與細(xì)胞增殖、存活等多種細(xì)胞進(jìn)程,并在炎癥反應(yīng)、癌癥及其他病變中起調(diào)節(jié)作用[1].ABL最初被認(rèn)為能治療白血病[2],為腫瘤治療提供新的方法.但近期研究表明,結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等實體瘤中ABL激酶的高表達(dá)和活化會引起細(xì)胞極性、侵襲、生長的改變[3-4].目前,美國食品和藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)的抑制ABL激酶的藥物包括伊馬替尼和達(dá)沙替尼,已經(jīng)用于實體瘤的檢測[5].然而,由于實體瘤中信號通路激活后的復(fù)雜性以及耐藥性的出現(xiàn),這些抑制劑很可能具有多個靶細(xì)胞位點.因此,增強(qiáng)ABL抑制劑的特異性或與其他抗癌藥物聯(lián)合用藥以降低耐藥性顯得尤為重要.

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)能夠通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的受體DR4,DR5來選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,對正常細(xì)胞沒有毒性[6],已成為新型抗腫瘤藥物.然而,部分惡性腫瘤細(xì)胞降低了對TRAIL的敏感性甚至完全耐受[7].因此,聯(lián)合一些放化療藥物如順鉑(cisplatin)、阿霉素(doxorubicin,DOX)、5-氟尿嘧啶(5-f l uorouracil)等增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性已成為新的研究熱點[8].另外,TRAIL能夠聯(lián)合放化療藥物或小分子抑制劑(如PI3K,HSP90等)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[9-11].本工作證實了DOX能增強(qiáng)HT29細(xì)胞對TRAIL的敏感性,發(fā)現(xiàn)ABL的基因沉默能夠抑制HT29細(xì)胞的增殖,但同時也能抑制細(xì)胞對TRAIL的敏感性,并且會減弱DOX增強(qiáng)TRAIL敏感性的作用.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞和人腎上皮細(xì)胞293T購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection,ATCC),均用含10%胎牛血清(Sigma公司)和1%青霉素-鏈霉素的DMEM(Dulbecco’s modif i ed Eagle medium)培養(yǎng)基(Gibico公司)于含5%CO2,37?C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).常規(guī)消化及傳代,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實驗.

1.2 試劑

TRAIL購于美國Peprotech公司,阿霉素和嘌呤霉素均購于Sigma公司.兔抗人抗體β-actin,ABL,PARP1,cleaved-caspase3和兔二抗IgG均購于Cell Signaling公司.轉(zhuǎn)染試劑GeneTran TMⅢ(BIOMIGA)購于上海妙駿生物科技有限公司.細(xì)胞計數(shù)試劑盒8(cell count kit8,CCK8)和二辛可寧酸(bicinchonininc acid,BCA)蛋白定量試劑盒均購于碧云天生物技術(shù)有限公司.

1.3 方法

1.3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建

構(gòu)建ABL knockdown和過表達(dá)的慢病毒載體,其中shRNA有效序列為5’-GCAGTCATGAAAGAGATCAAACTC-3’,以空載體plko.1-non-target作為對照.重組質(zhì)粒與輔助包裝載體(PSPAX2和PMD2.G)共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞,空載體與輔助包裝載體共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞作為對照,48 h后離心收集病毒上清.將病毒與生長培養(yǎng)基1∶1(摩爾比)混合后侵染結(jié)腸癌HT29細(xì)胞,24 h后換取新鮮培養(yǎng)基并用摩爾濃度為1μg/mL的puromycin進(jìn)行持續(xù)篩選培養(yǎng).1周左右可獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng).將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染plko.1-non-target和plko.1-ABL-shRNA質(zhì)粒的HT29細(xì)胞分別命名為HT29-NT和HT29-ABL-Kd;將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠ABL過表達(dá)質(zhì)粒的HT29-ABL-Kd細(xì)胞命名為HT29-rescue;將未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白細(xì)胞命名為HT29-parental.最后用Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞中ABL的表達(dá)水平.

1.3.2 CCK8檢測細(xì)胞增殖和藥物毒性

細(xì)胞增殖檢測:將細(xì)胞按照每孔2 000個接種于96孔板,培養(yǎng)4 h,待所有細(xì)胞貼壁后,進(jìn)行第一次CCK8檢測,設(shè)為0 h,分別在之后的24,30,48,60,72 h加入CCK8溶液,37?C孵育2 h.用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測各孔吸光值.進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時,將不同時間培養(yǎng)的細(xì)胞的吸光值標(biāo)準(zhǔn)化為第一次(0 h)檢測吸光值.

藥物毒性檢測:將每孔8 000個細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,分別加入不同摩爾濃度的DOX(0,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0μg/mL)和TRAIL(0,1,5,10,20,50,100,200,500,1 000 ng/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h.更換新鮮培養(yǎng)液,加入CCK8溶液,于450 nm處測定吸光值.進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時,將不同摩爾濃度藥物處理獲得的吸光值標(biāo)準(zhǔn)化為濃度是0的吸光值.

1.3.3 Western blot檢測ABL蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

細(xì)胞加藥處理24 h后,裂解細(xì)胞,提取總蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量.10%或12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)膜,使蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene f l uoride,PVDF)膜上.轉(zhuǎn)膜完成后,用三乙醇胺緩沖鹽水(triethanolamine buあered saline,TBS)溶液配制含5%脫脂奶粉的封閉液,孵育2 h.然后加入β-actin,ABL,PARP1,cleaved-caspase3一抗孵育過夜,三羥甲基氨基甲烷鹽酸吐溫緩沖液(Tris buあered saline with Tween,TBST)洗膜后,再孵育辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的兔二抗.用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminecence,ECL)試劑盒顯影,拍照.

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期細(xì)胞3×105接種于6孔板,24 h后單獨或聯(lián)合加入亞毒性劑量的TRAIL 100 ng/mL和0.5μg/mL的阿霉素,繼續(xù)培養(yǎng)24 h.磷酸鹽緩沖液(phosphate buあer saline,PBS)洗兩遍,胰酶消化,收集細(xì)胞,加入AnnexinⅤ染色.用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,并統(tǒng)計細(xì)胞凋亡率.

2 結(jié)果與分析

2.1 ABL沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建及其對結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示,與對照細(xì)胞HT29-NT相比,ABL knockdown細(xì)胞HT29-ABL-Kd中ABL蛋白表達(dá)量被顯著下調(diào)(大于70%)(見圖1(a)),說明轉(zhuǎn)染plko.1-ABL-shRNA質(zhì)粒后,該重組質(zhì)粒能夠有效沉默結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中的ABL基因,成功構(gòu)建了ABL沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株HT29-ABL-Kd.用CCK8檢測ABL沉默對HT29細(xì)胞增殖活性的影響,結(jié)果顯示ABL沉默能夠明顯抑制HT29細(xì)胞的增殖,在30,48,60,72 h,HT29-ABL-Kd的細(xì)胞增殖顯著低于HT29-NT對照組(見圖1(b),其中**表示P＜0.01).

圖1 不同轉(zhuǎn)染后的結(jié)腸癌細(xì)胞中ABL蛋白水平和ABL沉默對HT29細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Levels of ABL in diあerent transformed colorectal cancer cells and the eあects of ABL silencing on cell proliferation

2.2 DOX,TRAIL對結(jié)腸癌HT29細(xì)胞活性的影響

不同摩爾濃度DOX,TRAIL對HT29細(xì)胞活性影響的檢測結(jié)果如圖2所示,其中*表示與對照組相比P＜0.05,**表示P＜0.01.由圖可見,DOX對HT29細(xì)胞的抑制作用具有濃度依賴性,即隨著藥物濃度的增加,HT29-ABL-Kd細(xì)胞與對照組細(xì)胞的存活率均呈下降趨勢(見圖2(a)).所得的DOX誘導(dǎo)HT29細(xì)胞調(diào)亡的亞毒性劑量0.5μg/mL可用于后續(xù)實驗.TRAIL對HT29細(xì)胞的抑制作用也具有濃度依賴性,然而高濃度TRAIL對HT29-ABL-Kd細(xì)胞的抑制作用明顯低于對照組(見圖2(b)).TRAIL誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡的亞毒性劑量50或100 ng/mL可用于后續(xù)實驗.結(jié)果表明,ABL沉默對阿霉素誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞凋亡基本沒有影響,但會抑制TRAIL對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響.

圖2 不同摩爾濃度DOX,TRAIL對HT29細(xì)胞活性的影響Fig.2 Inhibitive eあects of HT29 cells viability after treated with various concentrations of DOX or TRAIL

2.3 ABL沉默對TRAIL和DOX誘導(dǎo)凋亡的影響

亞毒性劑量的TRAIL,DOX單獨及聯(lián)合作用于HT29-ABL-Kd細(xì)胞和對照組細(xì)胞時,均會發(fā)生細(xì)胞凋亡,并且聯(lián)合作用的細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨作用時.另外,ABL沉默對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡并沒有明顯影響,對DOX誘導(dǎo)的凋亡有促進(jìn)作用,并且對TRAIL和DOX聯(lián)合誘導(dǎo)的凋亡有明顯抑制作用(見圖3,其中**表示P＜0.01).可見,結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中ABL的沉默會抑制TRAIL和DOX聯(lián)合促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測ABL沉默對TRAIL,DOX單獨和聯(lián)合誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Eあects of ABL silencing on the apoptosis rates of TRAIL,DOX alone or co-induced HT29 cell apoptosis detected by f l ow cytometry

2.4 ABL沉默對TRAIL和DOX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

50或100ng/mL的TRAIL單獨作用于HT29-ABL-Kd和對照組細(xì)胞時,PARP1和caspase3會發(fā)生剪切,cleaved PARP1(86 kD)和cleaved-caspase3(19和17 kD)表達(dá)量增加.實驗結(jié)果表明,單獨使用TRAIL能夠促進(jìn)HT29-ABL-Kd細(xì)胞和對照組細(xì)胞的凋亡.0.5μg/mL的DOX單獨作用于HT29-ABL-Kd細(xì)胞和對照組細(xì)胞時,cleaved PARP1表達(dá)量增加,說明DOX也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡.聯(lián)合使用0.5μg/mL的DOX與50或100 ng/mL的TRAIL可以使cleaved PARP1和cleaved-caspase3的表達(dá)量均增加且高于單獨作用時(見圖4(b)).相應(yīng)用藥的細(xì)胞經(jīng)流式分析的凋亡率與上述結(jié)果一致(見圖4(a)).圖4(a)和(b)中的ct代表未轉(zhuǎn)染任何載體的HT29細(xì)胞,Kd代表HT29-ABL-Kd細(xì)胞.以上結(jié)果表明,聯(lián)合使用0.5μg/mL的阿霉素和100 ng/mL的TRAIL可以有效促進(jìn)結(jié)腸癌HT29細(xì)胞的凋亡,而ABL沉默會抑制DOX和TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡.

圖4 HT29細(xì)胞凋亡蛋白量化圖和Western blot圖譜Fig.4 Apoptosis protein quantif i cation map and Western blot of HT29 cell

3 討論

ABL最初被認(rèn)定為是能夠引發(fā)白血病的癌基因,目前一些小分子抑制劑如伊馬替尼能有效治療惡性腫瘤.前期研究發(fā)現(xiàn),ABL沉默能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖.TRAIL能夠誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡,如HGS-ETR1(mapatumumab)已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗階段[12].但是,多種腫瘤細(xì)胞對TRAIL具有耐受性,這可能與TRAIL受體的下調(diào)、抗凋亡蛋白的增加等因素相關(guān).有研究表明,聯(lián)合一些放化療藥物增加TRAIL的敏感性已成為抗腫瘤的新方法.TRAIL聯(lián)合5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等化療藥物可以增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-14].DOX是一種能夠有效治療乳腺癌、肝癌的化療藥物,而針對結(jié)腸癌的相關(guān)研究還很少[15-16],TRAIL,DOX聯(lián)合ABL沉默共同抗腫瘤的研究則更少.因此,本課題將TRAIL,DOX聯(lián)合作用于結(jié)腸癌HT29細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOX能夠顯著提高TRAIL誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡的能力,這可能與DOX能增強(qiáng)死亡受體DR5的表達(dá)來增強(qiáng)TRAIL的敏感性有關(guān).另外,也可能與一些凋亡相關(guān)蛋白caspase-3及caspase-8的表達(dá)相關(guān),其具體潛在的機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究.本工作還將ABL基因沉默聯(lián)合TRAIL,DOX共同作用于HT29細(xì)胞.結(jié)果表明,ABL基因沉默對DOX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基本沒有影響,但會抑制TRAIL和TRAIL聯(lián)合DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,這可能是由于ABL沉默后對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡通路的影響與TRAIL對其凋亡通路的影響不一致所引發(fā)的.另外,在ABL沉默的細(xì)胞HT29-ABL-Kd中恢復(fù)ABL的表達(dá),則TRAIL,TRAIL聯(lián)合DOX對HT29-rescue細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的抑制作用也會減弱.

綜上所述,TRAIL,DOX聯(lián)合用藥可以有效殺傷結(jié)腸癌HT29細(xì)胞.雖然ABL沉默能抑制HT29細(xì)胞的增殖,但在結(jié)腸癌HT29細(xì)胞中抑制ABL的表達(dá)并不能促進(jìn)DOX和TRAIL協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,反而會減弱DOX和TRAIL聯(lián)合用藥的作用.因此,TRAIL和DOX不能與抑制ABL激酶活性的藥物共同作用于結(jié)腸癌細(xì)胞.這一研究成果為TRAIL聯(lián)合用藥治療結(jié)腸癌提供了理論指導(dǎo).

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