氯磺隆和鎘復(fù)合污染對菠菜幼苗生理指標的影響

趙麗娟 ，張 洪 ，解靜芳 ，張建華

（1.忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州 034000；2.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，山西太原 030006；3.山西省分析科學(xué)研究院，山西太原 030006）

氯磺隆作為磺酰脲類除草劑的代表品種，在我國的玉米栽培中被廣泛使用，但是施用過程中產(chǎn)生了諸多問題，其中最為突出的是農(nóng)田土壤中的殘留藥害[1]。STORK[2]報道，氯磺隆在土壤中的殘留可持續(xù)3～5 a，從施用到分解的過程中，氯磺隆降解至初始濃度的1%的時間需要33～63個月，并且仍然會對后續(xù)播種的敏感作物產(chǎn)生一定的藥害。同時，我國北方地區(qū)由于缺水而導(dǎo)致的工業(yè)污水灌溉極為普遍，從而造成了土壤中重金屬鎘（Cd）積累。在土壤中，Cd對作物的毒害作用較為突出，因此，《土壤環(huán)境質(zhì)量標準》規(guī)定，Cd的限定值比其他重金屬（Hg，Pb，Cr，As）更加嚴格[3-5]。作物通過土壤吸收和污水灌溉之后，Cd濃度在組織中產(chǎn)生積累，作物生理表現(xiàn)為：植株矮化、根系發(fā)黑變短，甚至?xí)霈F(xiàn)分蘗受抑制，以致于作物的品質(zhì)和產(chǎn)量都會下降[6]。目前，由于現(xiàn)代工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，農(nóng)田土壤體系中的單一污染幾乎不存在，多種污染物共同作用于作物常有發(fā)生。

本試驗通過對土壤中的氯磺隆單一污染及氯磺隆和鎘的復(fù)合污染下，菠菜幼苗抗氧化酶活性和葉綠素含量的變化研究，旨在為土壤中2種污染物對波菜的聯(lián)合毒性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菠菜（Spinacia oleracea L.）種子為日本翠玉大菠（山西大豐種業(yè)有限公司）。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶試劑盒（上海紀寧公司）；氯化鎘（GR）（天津科密歐公司）；萬分之一天平（AL104，METTLER TOLEDO公司）；光照培養(yǎng)箱（LI15，美國SHELLAB有限公司）；紫外分光光度計（UV2100，UNICO公司）；高速冷凍離心機（JXN-30，BACKMANCOULTER公司）。

1.3 方法

根據(jù)氯磺隆對菠菜生長的抑制率進行預(yù)試驗，設(shè)置土壤中氯磺隆含量分別為0.000 1，0.000 3，0.001，0.003，0.005 mg/kg。根據(jù)文獻研究，國內(nèi)污灌區(qū)農(nóng)田土壤中Cd濃度最高可達5.0 mg/kg[7-8]，因此，選取5.0 mg/kg作為土壤中Cd的添加量。毒理學(xué)試驗設(shè)單一污染和復(fù)合污染2組，單一組只添加5個不同濃度的氯磺隆，復(fù)合組為Cd（5.0 mg/kg）＋5個不同濃度的氯磺隆。每組設(shè)空白對照，每個處理6次重復(fù)。

將500 g耕作層土與氯磺隆和Cd混合均勻，裝入缽體種植菠菜。種子埋好，放入光照培養(yǎng)箱。保持12 h晝夜交替，相對濕度（RH）40%～60%；溫度（20±2）℃；每日固定時間給菠菜澆水。當(dāng)作物幼苗長出2片真葉時，每缽定植5株。菠菜種植至第40天，取各處理組的植株進行葉綠素含量、抗氧化物酶活性的測定。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 波菜的抗氧化酶活性的測定 取0.2 g菠菜樣品，加入5 mL內(nèi)含1%的聚乙烯吡咯烷酮、pH值為7.8的磷酸鹽（PBS）溶液，0℃下進行研磨，設(shè)置離心機6 000 r/min，4℃離心10 min。取上清液，進行酶活性測定[9]。

超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍四唑法進行測定[10]。過氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚法進行測定[11]。過氧化氫酶（CAT）測定方法參考李合生[12]的《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》進行。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）采用上海紀寧公司生產(chǎn)的試劑盒進行測定。

1.4.2 丙二醛（MDA）和葉綠素含量的測定 取菠菜樣品0.5 g，5 mL0.1%三氯乙酸冰浴研磨，7 000 r/min離心30 min，取2 mL上清液，加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸，95℃水浴充分反應(yīng)30 min，放置室溫，10 000 r/min 離心 8 min。于 605，530，455 nm 測定吸光值。計算MDA含量[13]。

稱取菠菜0.1 g，加入8 mL80%丙酮溶液研磨，7 000 r/min離心10 min。上清液在663，645 nm測定吸光值，推算總?cè)~綠素的含量[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均取3次重復(fù)的平均值，采用標準差和T檢驗的方法分析不同處理之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對菠菜SOD活性的影響

細胞中O2-·主要由SOD進行清除，O2-·可由SOD催化轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，由此阻止生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而對生物膜起到保護作用[15]。

圖1結(jié)果顯示，與對照相比，Cd單一污染對SOD酶活性不會產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)土壤中氯磺隆含量超過0.003 mg/kg時，菠菜食用部分中的SOD活性才會顯著增加（P＜0.05）；Cd與氯磺隆的復(fù)合污染與氯磺隆單一污染相近，同樣為氯磺隆含量超過0.003 mg/kg時，SOD活性顯著增強。2組試驗結(jié)果表明，土壤中氯磺隆的含量對菠菜體內(nèi)的SOD產(chǎn)生主導(dǎo)作用，Cd影響不顯著。

2.2 不同處理對菠菜POD活性的影響

POD是植物體內(nèi)所產(chǎn)生的一類氧化還原酶，能催化很多反應(yīng)。在植物代謝中，由于各種生理還原底物不同而具有不同的功能，主要對H2O2的清除起關(guān)鍵作用[16]。

在氯磺隆的單一和復(fù)合污染處理組，菠菜POD隨著氯磺隆含量的升高，活性顯著增強（P＜0.05），當(dāng)氯磺隆含量為0.000 3 mg/kg時，單一污染對菠菜POD酶活性與對照之間無顯著差異，但是在加入Cd之后，菠菜處于二者的聯(lián)合暴露，POD活性顯著上升（P＜0.05）。表明2種污染物的聯(lián)合作用對菠菜的生理產(chǎn)生更強的毒性，且二者呈現(xiàn)正相關(guān)效應(yīng)（圖 1）。

2.3 不同處理對菠菜CAT活性的影響

CAT可清除植物組織中H2O2，使之分解成O2和H2O，主要存在于植物過氧化物酶體內(nèi)，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一[10]。

由圖2可知，氯磺隆單一暴露下，隨著氯磺隆含量的增加，菠菜CAT活性顯著增強（P＜0.05）。與對照相比，Cd單一暴露組CAT活性無顯著性差異（P＞0.05）。在Cd和氯磺隆聯(lián)合暴露下，CAT活性較氯磺隆單一暴露組增強更快，由此表明，二者的聯(lián)合暴露會對CAT活性會產(chǎn)生刺激作用。

2.4 不同處理對GST活性的影響

GST可以催化還原型谷胱甘肽（GSH）與各種親電子外源化合物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，從而防止親電子外源化合物進入生物體內(nèi)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，從而達到解毒的作用，是植物體內(nèi)重要的解毒酶。對各種有機污染物、農(nóng)藥、重金屬可起到解毒的作用[17-18]。

氯磺隆單一污染、氯磺隆與Cd復(fù)合污染對菠菜中GST的影響相同，都呈現(xiàn)出隨濃度增加GST先上升后下降的趨勢（圖2），可能是由于菠菜暴露在混合污染物中，在低濃度時，GST參與對外源毒物的解毒反應(yīng)，因此，活性上升；但隨著暴露含量的增加，其體內(nèi)底物GSH被大量消耗，從而導(dǎo)致GST的活性迅速降低。

2.5 對菠菜中MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的重要分解產(chǎn)物，其含量可以反映生物的抗性生理指標，進而間接地表達膜系統(tǒng)受到傷害的程度。從圖3可以看出，菠菜在氯磺隆單獨暴露下，土壤中農(nóng)藥濃度含量為0.000 3，0.001 mg/kg時，MDA含量顯著上升，在0.005 mg/kg濃度時表現(xiàn)為含量顯著下降，其總體趨勢表現(xiàn)為隨著氯磺隆含量濃度的增加呈先上升后下降的變化趨勢。

復(fù)合污染處理組，菠菜的丙二醛含量在5.0＋0.003 mg/kg顯著升高（P＜0.05），5.0＋0.005 mg/kg處理組顯著下降（P＜0.05），其余處理組與對照相比，無顯著性差異（圖3）。在2種復(fù)合污染物的同時暴露下，其總體變化趨勢為：隨著氯磺隆濃度的增加，MDA的含量呈先上升后下降，但是下降的趨勢要比氯磺隆單獨暴露出現(xiàn)的濃度更低。其可能是由于低含量氯磺隆單一和聯(lián)合暴露組，都尚未對菠菜細胞膜和細胞造成傷害；而當(dāng)氯磺隆含量達到一定的閾值時，細胞膜被損傷，隨即產(chǎn)生MDA的積累；之后呈下降趨勢，則可能是因為抗氧化酶活性的增強，清除了過多的活性氧，從而保護細胞膜，使得MDA含量恢復(fù)到正常水平。

2.6 不同處理對菠菜葉綠素含量的影響

由圖3可知，隨著氯磺隆含量的增加，菠菜中葉綠素含量出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05）。與對照相比，氯磺隆含量達到0.005 mg/kg，菠菜的葉綠素含量下降到0.6 mg/g。

與空白相比，Cd誘導(dǎo)菠菜葉綠素含量顯著下降（P＜0.05）。Cd造成菠菜葉綠素含量下降的原因可能是由于Cd離子會減少菠菜中葉綠體基粒、類囊體的數(shù)量，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，從而致使葉綠素含量降低[19]。氯磺隆與Cd復(fù)合污染后，未加快菠菜葉綠素含量的下降，由此可見，復(fù)合污染物對作物葉綠素含量未產(chǎn)生協(xié)同作用。

3 結(jié)論與討論

氯磺隆在單一污染和復(fù)合污染過程中均會誘導(dǎo)菠菜幼苗中SOD，CAT，POD活性顯著升高。Cd的單一污染對菠菜幼苗POD，SOD，CAT和GST這4種抗氧化酶活性不產(chǎn)生顯著影響；復(fù)合處理組與氯磺隆單一處理組和Cd單一處理組相比較，POD和CAT活性在復(fù)合處理組均顯著加強，由此表明，Cd和氯磺隆復(fù)合對POD和CAT活性可產(chǎn)生刺激作用，這樣可使植物清除體內(nèi)過多的活性氧和H2O2，MDA含量與二者的變化趨勢相同，也可對此進行印證。此外，GST活性在復(fù)合污染處理高濃度組顯著下降，表明谷胱甘肽除了需要結(jié)合氯磺隆，還需結(jié)合重金屬Cd，由于結(jié)合的底物較單一污染多，所以，酶活性下降較快。綜合以上各種酶活性變化結(jié)果表明，當(dāng)氯磺隆和Cd共同作用菠菜幼苗時會產(chǎn)生正協(xié)同效應(yīng)。單一污染與復(fù)合污染都會降低菠菜幼苗中的葉綠素含量，但是2種處理間無顯著性差異。

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