玉米強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)組合的基因型分析與分子預(yù)測(cè)

李 銳 ，馬海林 ,2,，白建榮 ，張 潔 ，關(guān) 超 ，楊瑞娟 ，張叢卓

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州 034000；3.山西大豐種業(yè)有限公司，山西太原 030031）

雜種優(yōu)勢(shì)是保證和提高玉米產(chǎn)量的重要原因。我國(guó)玉米生產(chǎn)和育種面臨的主要限制因素是種質(zhì)基礎(chǔ)薄弱。解決此問(wèn)題的重要途徑是從玉米多樣性中心系統(tǒng)引進(jìn)優(yōu)良種質(zhì)，并根據(jù)雜種優(yōu)勢(shì)模式原理進(jìn)行改良和利用。玉米是山西省的第一大作物，在山西有很多從事玉米育種的公司與研究單位。隨著商業(yè)化育種的進(jìn)程加快，育種家們從國(guó)內(nèi)外引進(jìn)了很多自交系，同時(shí)也對(duì)外引自交系按照育種目標(biāo)進(jìn)行改良。目前，很多自交系之間的親緣關(guān)系不清，雜種優(yōu)勢(shì)群的歸屬不明。如果對(duì)這些材料進(jìn)行廣泛組配，通過(guò)后代的表現(xiàn)選育優(yōu)良組合，但由于人力、物力、財(cái)力等因素的影響，只能進(jìn)行很少一部分的工作，并且由于環(huán)境因素的影響選擇效果并不會(huì)太理想。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展并逐步應(yīng)用于玉米遺傳多樣性分析中，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在玉米自交系的遺傳多樣性分析及雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分[1-7]、玉米品種指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析[8-18]、雜交種真實(shí)性與純度檢測(cè)[19-21]等方面大量應(yīng)用。很多育種人員迫切希望目前成熟的分子標(biāo)記技術(shù)及已測(cè)序完成的玉米基因組信息能應(yīng)用到實(shí)際的育種工作中，在基因型水平上預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)的親本組合，增加育種工作的目的性和預(yù)測(cè)性，加快育種進(jìn)程。但目前此方面的研究甚少。

本研究對(duì)山西大豐種業(yè)公司多年來(lái)收集和培育的大量自交系進(jìn)行了基因型分析和雜種優(yōu)勢(shì)群劃分；在此基礎(chǔ)上，以一個(gè)雜優(yōu)組合模式為例子，選擇出了一些候選親本自交系，并預(yù)測(cè)了一些潛在優(yōu)勢(shì)雜優(yōu)組合，這將為玉米自交系的高效選育和雜優(yōu)親本的最佳組配提供依據(jù)和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 自交系材料 1～81為收集與培育的自交系，82是先玉335、先玉508和先玉696的共同母本。83，84，85分別是先玉335、先玉508和先玉696的父本。86是鄭單958的母本鄭58，87是鄭單958的父本昌7-2（表 1）。

表1 試驗(yàn)材料

1.1.2 SSR標(biāo)記的引物 以中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1432—2014《玉米品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》）的20對(duì)核心引物和20對(duì)輔助核心引物作為標(biāo)記引物。

1.1.3 儀器與設(shè)備 擴(kuò)增產(chǎn)物在美國(guó)PE公司Labchip GXTouch大分子分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。使用HT DNA Extended Range LabChip微流體實(shí)驗(yàn)室芯片；HT DNA 1K Reagent Kit試劑盒；并使用LABCHIP GXT software USB軟件收集原始數(shù)據(jù)。Taq DNA聚合酶購(gòu)于寶生生物工程（大連）有限公司；引物和dNTP等試劑購(gòu)于上海生工生物技術(shù)有限公司。HTDNAExtended Range LabChip微流體實(shí)驗(yàn)室芯片和HT DNA 1K Reagent Kit試劑盒均購(gòu)于美國(guó)PE公司中國(guó)代理公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取、純化和檢測(cè) 采用混合提取法，每個(gè)供試材料2個(gè)樣本，每樣本由10個(gè)單株（隨機(jī)取樣）的葉片混合而成。采用CTAB法提取并純化DNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，調(diào)整DNA的工作液濃度為20 ng/μL，備用。

1.2.2 擴(kuò)增與產(chǎn)物熒光檢測(cè) 擴(kuò)增反應(yīng)在C1000擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)總體系為20 μL：10×PCR Buffer（25 mmol/LMg2+）2 μL，2.5 mmol/LdNTPs 1 μL，10 μmol/L SSR 引物 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 U，DNA模板 80 ng，ddH2O補(bǔ)足 20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性1 min，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析方法

1.3.1 遺傳多樣性分析與聚類(lèi) 利用Reviewer software USB軟件進(jìn)行圖像分析與數(shù)據(jù)收集。利用PowerMarker v3.25軟件分析統(tǒng)計(jì)每對(duì)引物的等位基因個(gè)數(shù)、基因型個(gè)數(shù)、等位基因頻率和多態(tài)性信息量（PIC），標(biāo)記索引系數(shù)（Marker Index，MI），按Senior等提供的公式MI＝Allele×PIC計(jì)算，Allele為該引物的等位基因數(shù)。利用NTSYS－pc2.1軟件按照UPGMA方法對(duì)各材料進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.3.2 雜優(yōu)類(lèi)群內(nèi)自交系差異位點(diǎn)比較 將雜優(yōu)類(lèi)群內(nèi)自交系的40個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增帶型進(jìn)行比較，找出相互之間位點(diǎn)差異數(shù)及具體位點(diǎn)。

1.3.3 雜優(yōu)組合的雜合位點(diǎn)數(shù)比較 將每個(gè)組配的雜優(yōu)組合的2個(gè)親本及每個(gè)源品種的2個(gè)親本的40個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增帶型組合成雜交種帶型，統(tǒng)計(jì)雜合位點(diǎn)數(shù)，每一位點(diǎn)是2條帶的是雜合位點(diǎn)。比較雜優(yōu)組合與源品種的雜合位點(diǎn)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 87個(gè)自交系的遺傳變異分析

表2 SSR引物在87個(gè)玉米自交系中的等位變異及多態(tài)信息量

續(xù)表2

87個(gè)自交系在40個(gè)SSR位點(diǎn)檢測(cè)到的遺傳變異匯總?cè)绫?所示。共檢測(cè)出256個(gè)等位變異，每對(duì)引物檢測(cè)出1～15個(gè)等位變異，平均6.4個(gè)；其中，bnlg16lk8位點(diǎn)有15個(gè)等位變異，9個(gè)位點(diǎn)的等位變異數(shù)在10個(gè)以上，反映了在這些位點(diǎn)有高度的等位變異性；有7個(gè)位點(diǎn)只檢測(cè)出3個(gè)及以下等位變異，其中，umc1492y13是一態(tài)，表明這些材料在這些位點(diǎn)高度純合。40個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量PIC值變化范圍在0.00～0.88，平均為0.59；PIC值在0.8以上有2個(gè)位點(diǎn)。標(biāo)記索引指數(shù)MI變化范圍在1.00～8.61，平均為3.02。PIC值和標(biāo)記索引指數(shù)MI值表現(xiàn)的趨勢(shì)和等位變異數(shù)的趨勢(shì)是類(lèi)似的。這些材料的雜合度均為0，表明參試自交系都為純系。

2.2 聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示（圖1），大部分材料之間的遺傳相似系數(shù)在0.77～0.98。在遺傳相似系數(shù)大約為0.80水平上可以將所有材料分為4大類(lèi)。其中，第Ⅰ類(lèi)包括4小類(lèi)，第1小類(lèi)包括82（PH6WC），表明此群為Reid種群；第2小類(lèi)包括鄭58；第3小類(lèi)和第4小類(lèi)來(lái)源不清。第Ⅱ類(lèi)分為2組，組1包括2個(gè)材料；組2分為2個(gè)組，其中一組包括83（PH4CV為335的父本）、84（PHB1M為508的父本）和85（PH5AD為696的父本），表明此類(lèi)屬于Lancaster種群。第Ⅲ類(lèi)包括9個(gè)材料，其中包括87（昌7-2），本群為塘四平頭群材料；第Ⅳ類(lèi)群包括4個(gè)材料，可能屬于新的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。

2.3 雜優(yōu)模式中親本群的選擇

從圖1可以看出有許多類(lèi)群以及它們的親緣關(guān)系，但是它們組成的雜種模式是否是雜種優(yōu)勢(shì)模式，還需要進(jìn)行許多研究。但是，我們知道先玉品種類(lèi)的親本組合是雜種優(yōu)勢(shì)模式之一，即Reid×Lancaster模式，但它們有共同的母本和各自的父本。實(shí)際育種工作中，很多育種家也是通過(guò)用本地種質(zhì)改良先玉號(hào)的親本獲得改良自交系，以保持該模式的雜種優(yōu)勢(shì)。從圖1可以看出，42，43，44和82（先玉母本） 構(gòu)成了先玉母本群；13，14，15，16，17，18 和84（508父本）構(gòu)成了 508父本群；19和 83（335父本）構(gòu)成了335父本群；30和85（696父本）構(gòu)成了696父本群。

2.4 先玉模式強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的親本預(yù)測(cè)

在選擇了改良親本群后，將對(duì)親本進(jìn)行組合。從表3可以看出，先玉335、先玉508和先玉696的雜合位點(diǎn)數(shù)分別為28，27，25個(gè)。82與各類(lèi)父本組合后，雜合位點(diǎn)數(shù)少于42與各類(lèi)父本組合的雜合位點(diǎn)數(shù)；43分別與各類(lèi)父本組合后，組合雜合位點(diǎn)數(shù)明顯少于相應(yīng)的對(duì)照，44分別與各類(lèi)父本組合后，組合雜合位點(diǎn)數(shù)明顯多于相應(yīng)的對(duì)照。因此，選擇母本為 42 和 44，父本選擇 13，14，15，16，17，18，19，30 及 83（335 父本）、84（508 父本）、85（696父本）進(jìn)行組配。42與16，17組配后的雜合位點(diǎn)數(shù)是25，都比508雜合位點(diǎn)少，從組合表中去除；42與83（335父本）、84（508父本）、85（696父本）組合后，分別與先玉335、先玉508、先玉696差異僅為2個(gè)位點(diǎn)，視為同質(zhì)品種，也去除。42與19組配后的雜合位點(diǎn)數(shù)是27，雖然沒(méi)有335雜合位點(diǎn)多，但也屬于多位點(diǎn)，應(yīng)考慮其中。經(jīng)比較后形成了推薦雜優(yōu)組合（表4）。

表3 玉米組合雜合位點(diǎn)分析

表4 玉米候選強(qiáng)優(yōu)組合

續(xù)表4

3 討論

雜種優(yōu)勢(shì)利用是玉米育種的基礎(chǔ)。為此，育種家們從實(shí)踐中總結(jié)出了許多雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群與各種雜優(yōu)模式。雖然，國(guó)內(nèi)雜優(yōu)類(lèi)群按照標(biāo)準(zhǔn)種質(zhì)劃分為6大類(lèi)[1]，但近年來(lái)，由于先玉品種和鄭單958在生產(chǎn)上的大面積推廣，大家普遍接受了這2種雜優(yōu)模式，很多育種家就是基于這2種模式進(jìn)行大規(guī)模種質(zhì)改良與組配雜交組合。因此，在育種中，主要按先玉母本群、先玉父本群、鄭58群和昌7-2群劃分雜優(yōu)類(lèi)群。本研究按這樣思路將所有自交系進(jìn)行了雜種優(yōu)勢(shì)類(lèi)群的劃分，使育種家們知道各自交系的歸群及親緣關(guān)系，指導(dǎo)他們有目標(biāo)地按照雜優(yōu)模式進(jìn)行組配。本研究也顯示還有一個(gè)新的類(lèi)群，有可能是一個(gè)新的雜優(yōu)類(lèi)群，建議加強(qiáng)對(duì)它的研究。

按照雜優(yōu)模式改良自交系，能方便應(yīng)用成熟的雜交模式培育新品種，近年來(lái)審定的很多品種就是這樣培育出來(lái)的，它們經(jīng)過(guò)改良有了一些新的特性如抗性或適應(yīng)性，又保持了原雜優(yōu)模式的強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)。但是，改良系很多，能組配的組合更多，如何產(chǎn)生有效的組合在實(shí)踐中產(chǎn)生了困難。本研究比較了改良系與來(lái)源品種親本的位點(diǎn)數(shù)，篩選出了有效親本自交系。但將所有組合與對(duì)照品種的雜合位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，不是所有組合的雜合位點(diǎn)數(shù)等于或大于對(duì)照品種。研究表明，如果僅簡(jiǎn)單地按目標(biāo)雜優(yōu)類(lèi)群進(jìn)行組配是不夠的，有必要進(jìn)一步把組合與對(duì)照品種的雜合位點(diǎn)數(shù)進(jìn)行比較后選擇。本研究建議的雜優(yōu)組合的分子預(yù)測(cè)方法在研究中已被證明。當(dāng)然，推薦的組合要經(jīng)過(guò)田間驗(yàn)證。

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