兩步酶法在小鼠睪丸支持細胞分離與培養(yǎng)過程中的研究

　　　　　　　　　　　*

1．貴州醫(yī)科大學，貴州　貴陽　550002；2．貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州　貴陽　550014

小鼠睪丸支持細胞是存在于小鼠睪丸生精上皮內(nèi)的一種非生殖細胞，對生殖細胞具有支持營養(yǎng)作用[1]，每個支持細胞都營養(yǎng)著一定數(shù)目的生殖細胞[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)其可通過旁分泌途徑分泌多種生長調(diào)節(jié)因子，如膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF、表皮生長因子EGF、轉(zhuǎn)化因子等，維持精原細胞周圍微環(huán)境為其提供營養(yǎng)支持并調(diào)控其增值及分化[4-6]。因此分離出高純度的支持細胞對研究精原細胞的增值并分化成為精子的過程具有重要意義。研究精子在體內(nèi)的發(fā)生機制及其影響因素，必須模擬其真實的體內(nèi)環(huán)境，分離高純度的支持細胞是其必要條件。以往國內(nèi)實驗分離過程較為繁瑣，純度不高，本實驗在文獻報道的基礎(chǔ)上改良分離方法，就如何簡便高效率的分離小鼠睪丸支持細胞并進行純化和鑒定做出初步探討，為今后進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與材料

1.1動物出生7～8 d的雄性昆明小白鼠，由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(薩默飛世爾科技有限公司)；clean work station潔凈操作臺(薩默飛世爾科技有限公司)；BECKMAN-COULTER臺式離心機；Nikon倒置顯微鏡；Axiocam-Mrc倒置熒光顯微鏡；電子天平(梅特勒托利儀器有限公司)；一抗波形蛋白(Proteintech公司)；二抗FITC標記的羊抗兔IgG(Proteintech公司)；膠原酶Ⅳ(北京索萊寶科技有限公司)；胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM/F-12培養(yǎng)基(Sigma公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2　方法

2.1原代小鼠睪丸支持細胞的分離取出生7～8d的雄性昆明小鼠15只，脫頸處死，泡置75%酒精5 min，消毒。于超凈工作臺內(nèi)，分離小鼠雙側(cè)睪丸，放入盛有PBS的培養(yǎng)皿中，并于培養(yǎng)皿中鈍性分離白膜。用吸管將睪丸轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，用PBS吹打洗滌3遍，充分去除白膜及睪丸周圍組織，去除上清。剪碎睪丸組織，加入10倍體積0.2%膠原酶Ⅳ，37 ℃水浴鍋消化10 min。加入5～10mLPBS輕輕吹打1～2 min,600 r/min離心2min，棄上清，重復(fù)2次。加入10倍體積的0.25%胰蛋白酶(無EDTA)，于37 ℃水浴鍋消化20 min，期間每3min搖晃吹打一次，使得睪丸組織充分接觸胰酶。加入等量含10%胎牛血清DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化，200目細胞篩過濾懸液。濾液于1000 r/min離心6 min，棄上清，加入10倍體積含10%胎牛血清DMEM/F-12培養(yǎng)基充分吹洗，重復(fù)3次。細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整濃度5×105個/mL接種于的含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2原代小鼠睪丸支持細胞的純化原代細胞培養(yǎng)6 h后取出，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，將未貼壁及貼壁不牢固的精原細胞游離，吸取丟棄培養(yǎng)液及游離的精原細胞。加入新的培養(yǎng)液。分別于12 h、18 h、24 h重復(fù)上述操作。培養(yǎng)至48h，0.25%胰蛋白酶(無EDTA)2 mL加入培養(yǎng)皿中，快速搖勻消化15 s，棄掉胰酶及消化下的剩余精原細胞。加入培養(yǎng)基搖晃清洗3遍后繼續(xù)至于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72h后重復(fù)上述步驟1次。

2.3小鼠支持細胞的鑒定

2.3.1形態(tài)學鑒定小鼠支持細胞培養(yǎng)6h開始貼壁，12h呈條梭型，24h胞體出現(xiàn)突觸，48h細胞進一步鋪展呈片狀。而精原干細胞則呈現(xiàn)圓形隨著培養(yǎng)連接呈圓形串珠樣，以此可初步鑒別。

2.3.2小鼠睪丸支持細胞的免疫學鑒定取培養(yǎng)2周支持細胞做鑒定，PBS洗滌2遍，3 min/遍。加入4%多聚甲醛固定20 min后PBS洗滌3遍，3 min/遍。加入4 mL的0.1%Tween-20(PBST)于培養(yǎng)皿10 min透化細胞，PBS洗滌2遍，3 min/遍。加入含5%BSA的PBST(封閉液)封閉細胞45 min。用一抗封閉液按1∶200稀釋一抗并加入培養(yǎng)皿，4 ℃冰箱過夜。二抗稀釋液洗滌細胞3遍，5 min/遍。用二抗封閉液按1∶200稀釋二抗并加入培養(yǎng)皿，37 ℃度培養(yǎng)箱放置90 min。PBS洗滌細胞3遍，加入DAP試劑覆蓋細胞表面1 min，PBS洗滌3次。熒光顯微鏡觀察。

3　結(jié)果

3.1倒置顯微鏡觀察初步分離的細胞為精原細胞及支持細胞混合懸液，由于兩種細胞均呈現(xiàn)游離狀態(tài)，顯微鏡觀察均呈現(xiàn)圓形，無法鑒別，培養(yǎng)6h左右開始貼壁生長，呈規(guī)則小圓形，精原細胞呈現(xiàn)游離狀態(tài)，形狀仍為規(guī)則圓形(圖1)。培養(yǎng)12h后，支持細胞進一步貼壁，呈現(xiàn)梭型，部分殘存精原干細胞呈圓形。培養(yǎng)24h后，可見支持細胞部分伸出突觸，細胞間仍有空隙(圖2)。培養(yǎng)72h，可見支持細胞平鋪于培養(yǎng)皿底部，呈片狀，伸出3～5個突觸，細胞之間相互接觸?？梢娂毎宋挥诎w中部或稍偏位(圖3)。

3.2DAPI染色DAPI是一種可以穿透細胞膜與細胞核中DNA結(jié)合的熒光染料。對支持細胞PI染色，在熒光顯微鏡下可見細胞核呈藍色，散在分布，細胞核的位置及支持細胞的位置所在(圖4)。

3.3免疫組化鑒定用支持細胞特異性抗體波形蛋白(一抗)標記支持細胞，用帶有綠色熒光的FITC標記的羊抗兔IgG(二抗)特異性結(jié)合一抗，于熒光顯微鏡下觀察到支持細胞呈現(xiàn)綠的片狀，相互接觸(圖5)。細胞位置與對應(yīng)的PI染色一致?？勺C明為存活的小鼠睪丸支持細胞。

4　討論

小鼠睪丸組織內(nèi)的支持細胞，是一種具有重要功能的間質(zhì)細胞，為精子的發(fā)育提供必要的微環(huán)境[7]。研究表明支持細胞的數(shù)量影響著睪丸的大小及睪丸中所發(fā)育成熟的精子的數(shù)量及質(zhì)量[8]。平均每個小鼠睪丸中能獲得細胞在105～106個左右，其中支持細胞占大部分[9]。對支持細胞進行高純度的分離及體外培養(yǎng)是進一步研究精子的發(fā)生發(fā)展的必要先決條件。1周左右小鼠睪丸生精小管組織中存在大量支持細胞且增殖活躍[10]。實驗選用出生7～8d小鼠，既保證了所獲取細胞的純度，又避免了小鼠過小帶來的取材不便等問題。目前分離與純化小鼠睪丸支持細胞的方法沒有一種較為統(tǒng)一的方法，以往報道的支持細胞分離純化方法有一步酶分離法，Percoll密度梯度分離純化法等，一步酶分離法實驗過程較為簡單，細胞存活率較高，但所得細胞純度不高且組織雜質(zhì)較多需要后續(xù)進一步去除。Percoll密度梯度分離法可將支持細胞及精原細胞充分分離，得到高純度的兩種細胞，但高速離心的時間就需20 min左右，長時間的高速離心會使得細胞受到離心力較大影響，使得分離所得細胞存活率較低，故所需的實驗原料過多，且此種方法對實驗儀器及實驗操作過程要求較高，實驗步驟較復(fù)雜不適宜初學者。此外還有免疫磁株分選法及免疫熒光分選法，此兩種方法成本過高，操作繁瑣，極大地限制了其應(yīng)用。實驗采用兩步酶分離法，第一步先去除睪丸中的間質(zhì)纖維等組織，第二步消化分離支持細胞。利用小鼠睪丸支持細胞貼壁速率不同，6 h時支持細胞基本已經(jīng)完成貼壁，而精原細胞大多仍呈現(xiàn)游離狀態(tài)，此時進行第一次換液，可以去除大部分精原細胞，為初步一次純化。此后利用差速貼壁多次換液進一步純化。因為多次震蕩換液，在48h時已使得精原細胞只有極少一部分不牢固的貼壁殘余，此時使用胰蛋白酶短時間快速消化并換液，使得這一部分殘余精原細胞被進一步去除，而活力較好的支持細胞則因為貼壁較為牢固而無法被短時間胰酶消化分離。本實驗多次驗證獲取的支持細胞純度可達到90%左右。相比于其他方法，此方法操作過程較為簡單，實驗成本較低，較易學習，獲取的支持細胞純度較高，可滿足后續(xù)實驗要求，可為初學者首選方案。

目前支持細胞的鑒定方法主要是形態(tài)學鑒定，采用倒置顯微鏡觀察及電鏡觀察；另一種鑒定方法是DNA免疫標記：觀察到特征性雙核仁結(jié)構(gòu)[11-13]；還有免疫組化法鑒定。本實驗選取形態(tài)學鑒定聯(lián)合PI染色及免疫組化鑒定的方法，先從大體形態(tài)學層面進行初步鑒定，再選用特異性免疫標記物波形蛋白進行免疫鑒定[14]。結(jié)果充分證實了本實驗方法可得到純度較高、存活率較高的小鼠睪丸支持細胞，為今后進一步研究奠定實驗基礎(chǔ)，值得推廣。

[1]郭杰,方南洙,李鐘淑,等. 睪丸支持細胞結(jié)構(gòu)、功能及研究進展[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2008, 27(1):40-42.

[2] Orth J M, Gunsalus G L, Lamperti A A. Evidence from Sertoli cells depleted rats indicate that spermatid number in adults depends on number of Sertoli cells produced during perinatal development[J]. Endocrinology, 1988, 122(3):787-794.

[3] Knobil E, Neill JD. The Physiology of Reproduction[M]. New York: Raven Press,1994.

[4] Wu Z, Templeman J L, Smith R A, et al. Effects of glial cell line-derived neurotrophic factor on isolated developing mouse Sertoli cells in vitro[J]. Journal of Anatomy, 2005, 206(2):175-184.

[5] Kubota H, Avarbock M R, Brinster R L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(47):16489-16494.

[7] 胡建新, 孫兆林, 何堅,等. 膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外培養(yǎng)小鼠精原干細胞增殖分化作用的影響[J]. 中華泌尿外科雜志, 2010, 31(4):227-230．

[8] Anthony C T, Danzo B J, Orgebincrist M C. Investigations on the relationship between sperm fertilizing ability and androgen-binding protein in the restricted rat [J]. Endocrinology, 1984, 114(4):1419-25.

[9] Allan C M, Garcia A, Spaliviero J, et al. Complete Sertoli cell proliferation induced by follicle-stimulating hormone (FSH) independently of luteinizing hormone activity: evidence from genetic models of isolated FSH action[J]. Endocrinology, 2004, 145(4):1587.

[10]張學明, 賴良學, 李德雪,等. 小鼠精原細胞的分離和純化[J]. 解剖學報, 2000, 31(3):235-238.

[11] Vergouwen R P, Jacobs S G, Huiskamp R, et al. Proliferative activity of gonocytes, Sertoli cells and interstitial cells during testicular development in mice[J]. Journal of Reproduction & Fertility, 1991, 93(1):233-243.

[12] Raychoudhury S S, Kubinski D. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced cytotoxicity in cultured rat Sertoli cells involves differential apoptotic response[J]. Environmental Health Perspectives, 2003, 111(1):33-38.

[13] 丁訓(xùn)誠,蔣學之.男性生殖毒理學[M].北京:中國人口出版社,1997: 230.

[14] 章靜波.細胞生物學實用方法與技術(shù)[M].北京:北京醫(yī)科大學,中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,2005:8-10.