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    高通量測序分析紅棕紫泥土土壤細菌多樣性

    2018-04-19 01:53:04張建華龐良玉林超文許文志楊育林向成華
    西南農(nóng)業(yè)學報 2018年3期
    關鍵詞:單胞菌群落菌群

    王 謝,張建華*,龐良玉,林超文,唐 甜,許文志,楊育林,向成華

    (1. 四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所, 四川 成都 610066; 2. 四川省林業(yè)科學研究院, 四川 成都 610081 )

    【研究意義】土壤微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)元素循環(huán)、有機物質(zhì)的形成和分解、土壤肥力的保持和提高、生態(tài)環(huán)境改善、植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)、作物病蟲害防治等方面起著極其重要的作用[1]。其中,土壤細菌是土壤微生物的重要組成部分,在土壤有機質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成、養(yǎng)分轉化與吸收等過程中起到重要作用,其群落結構組成及其多樣性變化是表征土壤環(huán)境質(zhì)量的敏感指標[2]。紅棕紫泥土為四川盆地丘陵區(qū)坡耕地主要的土壤類型,了解其土壤細菌群落結構,有助于了解區(qū)域土壤健康狀況、和發(fā)揮土壤潛在的肥力和生態(tài)功能,為區(qū)域農(nóng)林產(chǎn)品質(zhì)量的提升和農(nóng)田的可持續(xù)利用提供重要的參考依據(jù)。【前人研究進展】由于土壤微生物物種豐富、很多難以培養(yǎng)、且功能多樣,利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)、分離純化得到的微生物種群僅占土壤整個微生物群落的1 %[3]。【本研究切入點】目前,第二代測序技術已經(jīng)成為微生物群落結構研究的重要手段,利用高通量測序可檢測到環(huán)境中大量的不可培養(yǎng)的微生物存在, Rosello等估計每克土壤約含有幾千種微生物[4]。【擬解決的關鍵問題】本文以四川資陽土壤保護站坡耕地的紅棕紫泥土為研究對象,利用16S擴增子高通量測序技術,對其土壤細菌群落構成和多樣性進行研究,以期為未來進一步研究該地區(qū)土地利用方式與土壤生態(tài)功能調(diào)控奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 研究區(qū)概況

    土壤樣品于 2016年8月采集于四川省資陽市響水村(30°6’18.17” N,104°35’36.70”E, 405 m),該地區(qū)地貌以丘陵地形為主,氣候為亞熱帶季風氣候類型,年平均氣溫17 ℃,年平均降水量874 mm,年無霜期約311 d。

    1.2 樣地設置

    選擇附近3個典型的丘體,分別標為S1、S2和S3。在連續(xù)1周晴天后,按照樣線法[5]在其長期旱作的坡耕地上采集土壤樣品,共設置樣線 5條,用土芯取樣器采集表層0~40 cm土壤。最后,根據(jù)丘體和樣線進行編號,用四分法混合后取樣帶回。測序土樣裝入100 mL離心管中,-4 ℃下保存帶回實驗室待測。

    試驗土壤為侏羅紀遂寧組母質(zhì)發(fā)育的紅棕紫泥,長期種植模式為小麥套種玉米套種甘薯,土層厚40~60 cm,土壤層次分化不明顯,測試土壤理化性質(zhì)參見表1。

    1.3 DNA提取及測序

    準確稱取0.1 g土樣,采用MoBio試劑盒法,提取土樣的總DNA。經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳測定DNA完整性、MiniDorp測定DNA純度和濃度。每個樣地的5份DNA樣品隨機取3份等量混勻,分別制成3個平行樣本,于-20 ℃保存、備用。

    參考Caporaso等[6]的方法,通過細菌16S rDNA V4區(qū)段引物來擴增各樣品,其引物為515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。DNA擴增條件為98 ℃預變性1 min,98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個循環(huán),72 ℃延伸5 min[7]。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,使用HiSeq2500 PE250進行上機測序。

    1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

    將所測得原始序列截去Barcode序列和引物序列,利用FLASH(V1.2.7)[8]拼接獲得原始Tags數(shù)據(jù);利用Qiime(V1.7.0)[9]軟件過濾處理原始Tags數(shù)據(jù)獲得高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù),并與Gold database數(shù)據(jù)庫進行比對,檢測并去除其中的嵌合體序列[10],獲得有效數(shù)據(jù)。測序深度為每個文庫原始reads數(shù)不少于4萬條,以97 %相似性為依據(jù),利用UPARS Epipeline軟件將各序列聚類成為可執(zhí)行的分類操作單位(Operational taxonomic units,OTUs)。

    為獲得土壤樣品中微生物物種的多樣性信息,用Mothur方法與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析(設定閾值為0.8~1.0),統(tǒng)計界、門、綱、目、科、屬和種7個分類水平上的樣本的群落組成。使用PyNAST(V1.2)軟件與GreenGene數(shù)據(jù)庫中的 "Core Set" 數(shù)據(jù)信息進行快速多序列比對,得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關系。最后使用Qiime(V1.7.0)軟件計算土壤樣本微生物群落α多樣性的相關指數(shù),用Chao1指數(shù)和ACD指數(shù)表征菌群豐度,用Shannon多樣性指數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)表征菌群多樣性。

    2 結果與分析

    2.1 檢測到的可執(zhí)行的分類操作單位

    測序分析得到51 806~66 508條原始數(shù)據(jù),其中有效序列占98.52 %~98.93 %,最小長度為44 bp,最大長度為389 bp,平均長度253 bp。有效數(shù)據(jù)進行聚類,得到4296個OUT。其中,細菌界的相對豐度為98.91 %,古菌界的相對豐富度為1.09 %。所檢測到的細菌占所有分類物種的(11.39±1.64) %。

    表1 供試土壤的化學性質(zhì)

    所有樣品同時存在的有25個大的類群,分別是變形菌、擬桿菌、酸桿菌、厚壁菌、放線菌、芽單胞菌、疣微菌、浮霉菌、綠彎菌、藍菌、單糖菌、硝化螺旋菌、奇古菌、裝甲菌、綠菌、匿桿菌、JL-ETNP-Z39、衣原體、迷蹤菌、熱微菌、儉菌、TM6、食氫菌、螺旋體菌和纖維桿菌。此外,WCHB1-60、熱袍菌、SHA-109、嗜熱絲菌和同力菌存在于某兩座丘體坡耕地土壤中,異常球菌-棲熱菌、SM2F11、無壁菌、烏斯古菌、Candidate division OP3和暗黑菌僅存在于某一座丘體坡耕地土壤中。

    2.2 門水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

    在門水平上,相對豐富度排名前10的依次分別為變形菌門(49.52 %±4.60 %)、酸桿菌門(11.55 %±3.01 %)、擬桿菌門(10.87 %±1.65 %)、放線菌門(6.12 %±1.58 %)、芽單胞菌門(5.42 %±2.00 %)、疣微菌門(3.75 %±0.93 %)、厚壁菌門(2.4 %±0.92 %)、浮霉菌門(2.29 %±0.78 %)、綠彎菌門(2.03 %±0.84 %)和奇古菌門(1.09 %±0.10 %)。

    2.3 綱水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

    在綱水平上,相對豐富度排名前10的依次分別為β-變形菌綱(17.29 %±2.42 %)、γ-變形菌綱(13.16 %±2.42 %)、α-變形菌綱(11.92 %±2.78 %)、未鑒定的酸桿菌綱(10.04 %±2.89 %)、δ-變形菌綱(6.86 %±1.76 %)、鞘脂桿菌綱(5.59 %±1.15 %)、未鑒定的芽單胞菌綱(5.42±2.00 %)、纖維菌綱(4.07 %±0.48 %)、未鑒定的放線菌綱(4.03 %±1.42 %)和OPB35 soil group(2.29 %±0.57 %)。

    2.4 目水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

    在目水平上,相對豐富度排名前10的依次分別為伯克氏菌目(12.75 %±2.44 %)、黃單胞菌目(10.76 %±1.00 %)、Subgroup 6(5.93 %±1.44 %)、鞘脂桿菌目(5.59 %±1.15 %)、鞘脂單胞菌目(4.55 %±0.63 %)、噬纖維菌目(4.05 %±0.47 %)、芽單胞菌目(3.92 %±1.24 %)、粘細菌目(3.83 %±0.73 %)、Subgroup 4(2.9 %±1.06 %)和根瘤菌目(2.78 %±0.83 %)。

    2.5 科水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

    在科水平上,相對豐富度排名前10的依次分別為叢毛單胞菌科(8.99 %±2.44 %)、黃色單胞菌科 (8.33 %±0.79 %)、鞘脂單胞菌科(4.17 %±0.64 %)、Chitinophagaceae科(4.14 %±0.70 %)、芽單胞菌科(3.92 %±1.24 %)、噬纖維菌科(3.87 %±0.58 %)、草酸桿菌科(2.57 %±0.57 %)、亞硝化單胞菌科(1.55 %±0.35 %)、柄桿菌科(1.51 %±0.76 %)和RB41(1.40 %±0.50 %)。

    2.6 屬水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

    在屬水平上,相對豐富度排名前10的依次分別為溶桿菌屬(6.67 %±0.61 %)、鞘氨醇單胞菌屬(3.37 %±0.20 %)、Flavisolibacter屬(1.45 %±0.33 %)、馬賽菌屬(1.40 %±0.37 %)、Ohtaekwangia屬(1.29 %±0.07 %)、Blastocatella屬(1.12 %±0.46 %)、厭氧粘細菌屬(1.01 %±0.47 %)、芽單胞菌屬(0.97 %±0.34 %)、Pseudoduganella屬(0.92 %±0.36 %)和波單胞菌屬(0.84 %±0.53 %)。

    2.7 種水平上的土壤細菌優(yōu)勢種群

    在種水平上,相對豐富度排名前10的依次分別為變棕溶桿菌(0.82 %±0.98 %)、睪丸酮叢毛單胞菌(0.58 %±0.22 %)、厭氧性粘菌Fw109-5基因種(0.46 %±0.24 %)、日本硝化螺旋菌(0.36±0.15 %)、Steroidobacter菌WWH78基因種(0.36 %±0.05 %)、墨西哥假黃單胞菌(0.36 %±0.22 %)、Ellin517細菌(0.30 %±0.11 %)、莫氏根瘤菌(0.20 %±0.15 %)、疣微菌OR-59基因種(0.18 %±0.07 %)和纖維化纖維菌(0.17 %±0.10 %)。

    2.8 土壤細菌群落α多樣性

    就局域均勻生境下土壤細菌的物種數(shù)目而言,紅棕紫泥土中土壤細菌的物種組成復雜、多樣。在菌群豐度上,Chao指數(shù)為(2738.54±83.04)種,ACE指數(shù)為(2743.72±73.80)種;在菌群的多樣性上,Shannon多樣性指數(shù)為9.05±0.06,Simpson多樣性指數(shù)為0.99±0.0008。

    3 討 論

    3.1 變形菌、酸桿菌、擬桿菌為紅棕紫泥土優(yōu)勢類群

    本研究發(fā)現(xiàn)紅棕紫泥土中細菌以變形菌為主,約占所有細菌的50 %,其次為酸桿菌和擬桿菌,這三類型細菌占左右細菌的近70 %。該結果與其他一些土壤細菌多樣性的研究結果相似,如朱英波等[11]指出變形菌和酸桿菌是黑龍江農(nóng)田土壤細菌的優(yōu)勢菌群;韓晶等[12]指出變形菌和擬桿菌為博樂河入口濕地的優(yōu)勢菌群,兩者約占總克隆的65 %;張建萍等[13]指出變形菌占寧夏地區(qū)稻田土壤細菌的比例最大(37.8 %), 其次為酸桿菌(16.2 %)、放線菌(12.2 %)和擬桿菌(10.8 %)。

    3.2 變形菌的生態(tài)學功能

    變形菌種類繁多且生態(tài)功能多樣,對環(huán)境具有極強的適應性和變異性[14]。就本文中豐富度最高的叢毛單胞菌科和黃色單胞菌科細菌為例。叢毛單胞菌隸屬變形菌β亞綱,這一類細菌對于酚類、喹啉類等污染物的降解很早就被研究人員發(fā)現(xiàn),但由于遺傳背景的差異性, 不同的叢毛單胞菌可降解的污染物及降解特性都有所不同[15]。黃色單胞菌科隸屬變形菌γ亞綱,雖然是侵染葉片、誘發(fā)細菌性疫病的主要病原菌,但可用于農(nóng)藥降解[16]。

    3.3 酸桿菌的生態(tài)學功能

    酸桿菌是新近分出的一類細菌, 目前對它們研究還很少, 其在遺傳和代謝上具有很高的多樣性, 并在土壤等生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用[13, 17]。酸桿菌細菌一般具有嗜酸、寡營養(yǎng)、難培養(yǎng)的特點;但事實上并非如此,一些酸桿菌的基因序列也在中性、甚至堿性的環(huán)境中被檢測出來[18],本文的土壤環(huán)境也為堿性環(huán)境(pH≈8.8)。雖然現(xiàn)階段酸桿菌在自然環(huán)境中的功能還知之甚少[18],但有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酸桿菌具有許多編碼纖維素酶和半纖維素酶的基因[19]、部分菌種還具有異化鐵還原能力[20-21]。

    3.4 擬桿菌的生態(tài)學功能

    擬桿菌在人畜腸道中的絕對數(shù)量優(yōu)勢,具有的突出的糞源指示作用[22]。在土壤中,擬桿菌主要參土壤有機質(zhì)的分解[23]。張曉在研究林地恢復對土壤原核微生物群落結構的影響時也指出r策略細菌(變形菌門和擬桿菌門)的相對含量土壤碳凈礦化率成正比[24]。

    4 結 論

    紅棕紫泥土中土壤細菌的物種組成復雜、多樣,第一優(yōu)勢細菌類群為變形菌,第二優(yōu)勢細菌類群為酸桿菌和擬桿菌。

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