鐵皮石斛黑斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

孔 瓊，袁盛勇，王傳銘，薛春麗，郭建偉，李 珣，周銀麗，吳光梅

(紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 蒙自 661199)

【研究意義】鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是一種蘭科石斛屬藥用植物，具有滋陰清熱，益胃生津，潤(rùn)肺止咳等功效，富含石斛堿、石斛多糖等有效藥用成分[1]。由于大規(guī)模的采挖和自然繁殖率低等原因?qū)е铝髓F皮石斛野生資源稀缺，因此鐵皮石斛的人工種植逐漸增多。隨著人工種植面積的擴(kuò)大和年限延長(zhǎng)，大量的病害伴隨于鐵皮石斛的種植過程中，如炭疽病、疫病、黑斑病、莖基腐病、白絹病[2]，其中由黑斑病引起的鐵皮石斛病害發(fā)病較重，據(jù)筆者2012年4-12月于云南屏邊鐵皮石斛大棚種植基地的田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病發(fā)病率較重，高達(dá)30 %～50 %，嚴(yán)重影響了寄主植物的光合作用，從而導(dǎo)致了產(chǎn)量的降低?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌(Alternariasp.)、葉點(diǎn)霉(Phyllostictasp.)、柱盤孢(Cylindrosporiumsp.)均能引起石斛屬蘭科植物發(fā)生黑斑病[3-8]，不同寄主或地理區(qū)域下，其黑斑病的病原不盡相同。如前人研究發(fā)現(xiàn)引起浙江義烏和永康鐵皮石斛、貴州赤水金釵石斛、云南屏邊齒瓣石斛黑斑病的病原均為細(xì)極鏈格孢(Alternaria.tenuissima)[3-4,7-8]，而引起云南普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所試驗(yàn)基地石斛的黑斑病為柱盤孢(Cylindrosporiumsp.)[6]?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】對(duì)云南屏邊鐵皮石斛黑斑病病原和生物學(xué)特性方面的研究還未見報(bào)道，因此文章采取形態(tài)學(xué)和ITS序列對(duì)鐵皮石斛黑斑病的病原菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在對(duì)鐵皮石斛種植過程中該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2012年8月從云南屏邊鐵皮石斛種植基地采集鐵皮石斛黑斑病病標(biāo)樣，采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離[9]，并經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證后確定2株鐵皮石斛黑斑病病原，菌株編號(hào)為SA4和SA5。

1.2 方法

1.2.1 病原菌鑒定 病原菌落形態(tài)、分生孢子、產(chǎn)孢表型等特征觀察方法根據(jù)《中國(guó)真菌志-鏈格孢屬》進(jìn)行觀察和鑒定[10]。采用CTAB法提取SA4和SA5菌株的基因組DNA，通過真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增后[11]，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果于NCBI中BLAST上進(jìn)行比較分析，用MEGA5構(gòu)建各基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1000次重復(fù)。

1.2.2 病原菌生物學(xué)特性研究 采用在PCA上培養(yǎng)7 d的菌種，菌絲塊大小為4 mm×4 mm，培養(yǎng)溫度為27 ℃(除測(cè)定溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響外)，光照條件為L(zhǎng)∶D=12∶12(除測(cè)定光周期對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響除外)，于培養(yǎng)第7天測(cè)定菌落直徑和產(chǎn)孢量[12]。不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響。將菌種分別接入馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(PCA)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)和查氏培養(yǎng)基(Czapek)5種培養(yǎng)基中，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，同時(shí)測(cè)定產(chǎn)孢量。不同氮源對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響。以查氏(Czapek)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不加氮源作為對(duì)照，以甘氨酸、硝酸鈉、硫酸銨、蛋白胨、氯化銨為替換氮源，置換Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鉀，制成含有相同含氮量的不同氮源培養(yǎng)基。pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)率的影響。將病原菌菌絲塊分別接種到pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的PCA上培養(yǎng)7 d并測(cè)定其菌落直徑。用病原菌的分生孢子分別制成pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的孢子懸浮液，24 h后檢測(cè)萌發(fā)率，每次檢測(cè)100個(gè)孢子，在顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)率。溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。將菌絲塊分別置于5、15、20、25、27、30、35 ℃不同溫度下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，第7天測(cè)量菌落直徑。光周期對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。菌絲塊接種于PCA培養(yǎng)基上，并置于全光照、光暗交替(L∶D=12∶12)和全黑暗條件下培養(yǎng)，于第7天用測(cè)量菌落直徑。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPSv7.05進(jìn)行方差分析，再用Duncan法進(jìn)行多重比較，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

2.1.1 SA4形態(tài)特征 SA4菌株于PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d后，菌落中心略突起，直徑為5.39 cm，表面絮狀，灰色，背面黑色。在濕潤(rùn)濾紙上產(chǎn)孢良好，培養(yǎng)7 d形成2～6個(gè)孢子的鏈，少分枝，分生孢子梗單生或數(shù)根簇生，分生孢子單生或短鏈生，卵形，倒梨形，倒棒狀，淡褐色至褐色。具橫膈膜1～4個(gè)，縱、斜隔膜0～4個(gè)。孢身大小11.819～31.012 μm×9.721～16.029 μm(平均21.42 μm×12.88 μm)，短柱狀假喙0.948～20.059 μm×1.897～4.307 μm(平均10.50 μm×3.10 μm)(圖1)。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，鑒定為鏈格孢(Alternaria.alternata)。

2.1.2 SA5形態(tài)特征 SA5菌株在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6 d，菌落中心略突起，直徑為5.63 cm，菌落表面密絨狀，圓形灰白色，背面棕黃色，在濕潤(rùn)濾紙上產(chǎn)孢豐富，培養(yǎng)7 d形成4～10個(gè)孢子的鏈，多數(shù)分生孢子鏈不分枝，罕生的側(cè)鏈一般較短，分生孢子中間1～2個(gè)橫膈膜增厚，分生孢子梗單生或數(shù)根簇生，淡褐色，分生孢子鏈生，近球形，橢圓形，倒棒狀，具橫膈膜1～3個(gè)，縱、斜隔膜0～3個(gè)，孢身大小8.023～28.078 μm×9.370～14.360 μm(平均18.05 μm×11.87 μm)，柱狀假喙1.308～14.048 μm×2.392～4.499 μm(平均7.68 μm×3.44 μm)(圖2)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，鑒定為細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)。

2.2 致病性測(cè)定

根據(jù)柯赫氏法則，將SA4和SA5菌株接種于帶有傷口的鐵皮石斛葉片上，得到了黑斑病的典型癥狀，對(duì)照CK不發(fā)病，無癥狀(圖3)。SA4菌株在接種的第2天開始發(fā)病，而SA5菌株于接種第4天才發(fā)病，隨著時(shí)間的推移，病斑逐漸擴(kuò)大；第6天時(shí)，SA4菌株接種的葉片出現(xiàn)水漬狀和黑褐色的病斑，病斑較大，而SA5菌株表現(xiàn)為圓形的黑色病斑，且病斑較小。同時(shí)從病斑中重新分離獲得的病原菌與接種病原菌的菌落形態(tài)和菌體特征完全一致。

A: 菌落正面；B: 產(chǎn)孢表型；C: 分生孢子A: Front colony on PSA; B: Sporulation pattern; C: Conidia圖1 SA4菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of SA4 isolate

A：菌落正面；B：產(chǎn)孢表型；C：分生孢子A: Front colony on PSA；B: Sporulation pattern；C: Conidia圖2 SA5菌株的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of SA5 isolate

2.3 ITS序列分析

以SA4和SA5菌株的DNA為模板，用ITS1和ITS4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條介于500～750 bp DNA片段(圖4)，通過上海生工測(cè)序后發(fā)現(xiàn)SA4菌株的ITS DNA片段大小為528 bp，SA5為531 bp。將所獲得的序列與Gene Bank中鏈格孢屬(Alternaria)5個(gè)小孢子種(Alternarialongipes、A.gaisen、A.brassicae、A.alternata和A.tenuissima)的一些菌株進(jìn)行序列同源性比對(duì)，同時(shí)選取4個(gè)相似屬[假格孢屬(Nimbya)、細(xì)基格孢屬(Ulocladium)、埃里格孢屬(Embellisia)，匍柄霉屬(Stemphylium)]一些菌株ITS序列，采用MEGA 5.22中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。結(jié)果顯示SA4、SA5菌株與KC337037、KJ526175、HQ238277、JN108912、JQ004404的同源性高達(dá)99 %以上，同時(shí)聚在一個(gè)分枝，支持率為100 %，進(jìn)一步支持了鐵皮石斛黑斑病的病原菌是鏈格孢屬(Alternaria)真菌，但無法鑒定到具體的種。

圖3 SA4和SA5菌株接種6 d時(shí)的發(fā)病癥狀 Fig.3 Symptom of black spot disease with SA4 and SA5 after being inoculated for 6 days

2.4 病原菌生物學(xué)特性

2.4.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響 2種鏈格孢菌在PSA、PCA、PDA、CA、Czapek培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢(表1)。PDA培養(yǎng)基有利于促進(jìn)病原菌菌絲的生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)旺盛，直徑最大，且SA5菌株的菌落直徑明顯大于SA4菌株；而促進(jìn)鏈格孢菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為PCA培養(yǎng)基，該配方處理后的產(chǎn)孢量極顯著高于其他處理，其中SA4菌株的產(chǎn)孢量顯著高于SA5菌株的產(chǎn)孢量。

2.4.2 不同氮源對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響 2種鏈格孢真菌對(duì)供試5種氮源均能利用，但菌落直徑差異較大，同時(shí)在不含氮源的培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)，說明其對(duì)氮源要求不高，具體見表2。適合鏈格孢菌菌絲擴(kuò)展的氮源是硝酸鈉、甘氨酸和蛋白胨，顯著或極顯著高于其他處理；而適合鏈格孢產(chǎn)孢的氮源為硝酸鈉；而氯化銨和硫酸銨處理的菌落直徑明顯低于其他3種氮源的處理，且均不產(chǎn)孢。

圖4 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of SA4 and SA5 with ITS1 and ITS4

2.4.3 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)率的影響 在PCA培養(yǎng)基中，鏈格孢菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的pH值范圍較廣，對(duì)酸堿度有較強(qiáng)的適應(yīng)能力。其中pH為6時(shí)，SA4和SA5菌株的菌落直徑最大，極顯著高于其他處理；而孢子萌發(fā)率最高的pH為8，其產(chǎn)孢量極顯著高于其他處理(表3)。

圖5 SA4和SA5菌株構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SA4 and SA5 with NJ method by MEGA

培養(yǎng)基DifferentmediaSA4SA5菌落直徑(cm)Colonydiameter產(chǎn)孢量(個(gè))Sporulationquantity菌落直徑(cm)Colonydiameter產(chǎn)孢量(個(gè))SporulationquantityPSA7.30±0.00Aa4.00±1.00Cd7.67±0.21Bb1.33±0.58BbPCA7.75±0.22Aa12.00±1.00Aa7.45±0.13Bb5.00±1.00AaPDA7.40±0.36Aa6.00±1.00BCc8.87±0.06Aa1.33±0.58BbCA5.32±0.13Bb8.00±1.00Bb6.03±0.15Cd2.00±1.00BbCzapek5.50±0.31Bb0.67±0.58De6.37±0.26Cc2.00±1.00Bb

注：不同小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著；不同大寫字母代表在P<0.01水平差異極顯著，下同。

Note: Different capital letters meant significant difference at the 5 % level, and different lowercase letters meant significant difference at the 5 % level. The same as below.

表2 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

表3 不同pH對(duì)病原菌菌落和孢子萌發(fā)率的影響

2.4.4 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 SA4和SA5菌株在5～30 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，其中在25～30 ℃之間生長(zhǎng)較快，最適生長(zhǎng)溫度為27 ℃，其菌落直徑顯著高于其他處理；而低溫和高溫時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢(表4)。

表4 溫度對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響

2.4.5 光周期對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 不同光照處理對(duì)鏈格孢屬真菌的菌落生長(zhǎng)影響差異不顯著，說明菌絲生長(zhǎng)對(duì)光照的要求不高(表5)。但是2個(gè)不同鏈格孢菌種之間存在一定的差異，SA4菌株(細(xì)極鏈格孢)在有光照時(shí)，菌絲生長(zhǎng)較快；而是否有光照對(duì)SA5菌株(鏈格孢)的生長(zhǎng)影響不明顯。

3 討 論

3.1 鐵皮石斛黑斑病的病原鑒定

大量研究發(fā)現(xiàn)，很多植物病原能引起寄主植物葉片、葉鞘、枝條、果實(shí)發(fā)生黑斑病。如Alternariasp.侵染引起牡丹、石楠、梨、棗果、人參等花卉園林苗木、果樹和中草藥的黑斑病[13-17]；福建琯溪蜜柚黑斑病的病原是由亞洲柑橘葉點(diǎn)霉(Phyllostictacitriasiana)和中華柑橘葉點(diǎn)霉(Phyllostictacitrichinaensis)引起[18]，而柑橘黑斑病則是由柑桔球座菌(Guignardiacitricarpa)造成的[19]；湖南水稻葉鞘黑斑病則由假彎孢(Cochliobolusfallax)侵染引起[20]。雖然感病寄主植物的發(fā)病癥狀均表現(xiàn)為黑斑，但病原和發(fā)病部位卻不同，其中大多數(shù)病原為植物病原真菌，同時(shí)也有例外，如杧果黑斑病的病原是細(xì)菌(Xanthomonascampestrispv.mangiferae-indicae)[21]。因而植物黑斑病的病原鑒定工作尤為重要，同時(shí)應(yīng)根據(jù)病原和病害的田間流行規(guī)律制定出可行的防治措施。因此筆者調(diào)查了鐵皮石斛黑斑病的發(fā)生情況，并從田間采集病標(biāo)樣進(jìn)行室內(nèi)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)云南屏邊鐵皮石斛黑斑病病菌組成復(fù)雜，目前至少有2個(gè)種，分別為細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)和鏈格孢(Alternariaalternata)，其中細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)是在已報(bào)道的關(guān)于石斛黑斑病病原的文獻(xiàn)中較為常見的種，而鏈格孢(Alternariaalternata)較少有報(bào)道。

表5 不同光周期對(duì)病原菌菌落生長(zhǎng)的影響

鏈格孢屬真菌屬級(jí)特征明顯，而種級(jí)特征由于受環(huán)境條件影響變異幅度較大。在真菌鑒定時(shí)須采用單孢分離純化后的菌種，同時(shí)嚴(yán)格按照現(xiàn)代鏈格孢分離國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行鑒定，主要形態(tài)特征包括：分生孢子(形狀、大小、分隔情況、有無紋飾、產(chǎn)孢表型)；分生孢子梗(單生、簇生、分枝方式、延伸方式、產(chǎn)孢方式)；孢子鏈(長(zhǎng)度及孢子數(shù)目)；喙(有無、形態(tài)、長(zhǎng)短)[10]。同時(shí)文章對(duì)這2種鏈格孢菌進(jìn)行了ITS序列分析，發(fā)現(xiàn)該方法無法區(qū)分這2種鏈格孢菌，因此在進(jìn)行鏈格孢屬真菌種類鑒定時(shí)，應(yīng)側(cè)重于形態(tài)學(xué)鑒定，同時(shí)結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行，其中分子鑒定采用多基因(如OPA2-1、OPA1-3、RPB2、endoPG)測(cè)序后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行區(qū)分。

3.2 病原菌生物學(xué)特性

文章對(duì)鐵皮石斛黑斑病病原細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)和鏈格孢(Alternariaalternata)的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，這2種病原真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，很多能培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基和氮源都適合其生長(zhǎng)需求。菌絲生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基為PDA，產(chǎn)孢最適培養(yǎng)基為PCA；這與前人對(duì)其他鏈格孢屬真菌的研究結(jié)果相一致[22]。而對(duì)供試5種氮源均能利用，但是利用效率各有差異，最適氮源分別是蛋白胨和硝酸鈉，但是銨態(tài)氮?jiǎng)t明顯抑制2種鏈格孢屬真菌菌絲的生長(zhǎng)；菌落生長(zhǎng)最適pH為6，孢子萌發(fā)的最高pH為8；光照的有無對(duì)2種病原菌的菌絲生長(zhǎng)影響不大；病原菌在25～27 ℃生長(zhǎng)速度最快，而35 ℃以上就難以生長(zhǎng)。本研究結(jié)果與該病害在屏邊溫室大棚中易在6-8月侵染鐵皮石斛老葉，從而引起黑斑病的發(fā)病規(guī)律相吻合。

4 結(jié) 論

引起鐵皮石斛葉片黑斑病的病原菌為細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)和鏈格孢(Alternariaalternata)2種真菌，兩種病原菌的生物學(xué)特性有一定差異，且該病害易于高溫條件下傳播蔓延。

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