麻花艽×狹葉柴胡F1代β-amyrin合成酶基因表達(dá)及齊墩果酸含量分析

劉艷玲， 向鳳寧

(1.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院信息工程系，山東 萊蕪 271100；2.山東大學(xué)生命科學(xué)院 植物細(xì)胞工程與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，山東 濟(jì)南 250100)

【研究意義】中藥材的絕大多數(shù)有效成分都來源于次生代謝產(chǎn)物，隨著對植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)認(rèn)識和研究的不斷深入，應(yīng)用細(xì)胞融合方式向目標(biāo)植物中導(dǎo)入可表達(dá)的基因序列或者完整的生物合成途徑已成為可能，并逐漸發(fā)展為具有廣闊應(yīng)用前景的熱點研究領(lǐng)域[1-4]。高寒藏藥材—麻花艽(GentianastromineaMaxim.)系龍膽科、龍膽屬植物，分布于青海、西藏、甘肅等海拔2500～4700 m 的高寒地區(qū)，全草及根入藥，其主要有效成分為齊墩果酸、龍膽苦甙等，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、黃膽性肝炎、膽結(jié)石等病[5-7]。狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)為傘形科、柴胡屬植物，主要用于治療感冒發(fā)熱、胸肋腹痛等癥，是著名的抗病毒感冒中藥材[8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用細(xì)胞融合手段可以將代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，從而改變目標(biāo)產(chǎn)物的含量。Yun等在顛茄(Atropabelladonna)中引入編碼莨菪堿-6β-羥化酶的基因，結(jié)果使顛茄中含量很低的高價值托品生物堿東莨菪堿大量積累，并且?guī)缀跛械妮馆袎A都轉(zhuǎn)化成了東莨菪堿[9]；Shelagh等通過番茄CHI(chalcone isomerase)基因的超量表達(dá)使其果皮的類黃酮含量增加了78倍，其加工產(chǎn)品番茄醬中的類黃酮含量增加了21倍[10]。Shim等在人參中過量表達(dá)SQS基因，測得轉(zhuǎn)基因植物中人參皂甙的含量為對照的2.5倍[11]?！颈狙芯壳腥朦c】本實驗室已經(jīng)通過細(xì)胞融合的方式獲得了麻花艽和狹葉柴胡的雜種細(xì)胞系[12]，并已經(jīng)在親本中克隆了齊墩果酸合成的關(guān)鍵酶β-amyrin合成酶的基因序列[13]，分析了該基因在雜種細(xì)胞系中的表達(dá)方式，確定雜種細(xì)胞系中基因的變異與齊墩果酸含量的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以期為深入研究中草藥次生代謝奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

麻花艽、狹葉柴胡、雜種細(xì)胞系ZA、ZB、ZC。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因擴(kuò)增 ①引物。GsAS1正向引物P1：5′-GAATTCATGTGGAGGCTAAAAATCGG-3′；GsAS1反向引物P2：5′-CGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG-3′；GsAS2正向引物P3：5′-CTCGAGATGTGGAGGCTGAAGATCG-3′；GsAS2反向引物P4：5′-CTCGAGCGTCTCTCAAATCTTCAAGATGGCAA-3′。② 擴(kuò)增體系。采用20 μl PCR體系rTaq為大連Takara生產(chǎn)。反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 2.0 μl(1×)；MgCl2(25 mM)1.2 μl(1.5 mM)；dNTP(10 mM)0.2 μl(200 μM)；引物 各40 pmol；rTaq酶(5 U/μl)0.1 μl(0.5 U)；模板 50～200 ng；加水至20 μl；③擴(kuò)增程序。按照以下循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，57 ℃ 2.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。

1.2.2 β-amyrin合成酶基因的半定量RT-PCR 正向引物：5′-CCACCG(A)TTTTTG(A)CTCTGTA-3′；反向引物：5′-ACTTGGCTTTCGATA(T)CTTGG-3′；Tm：49 ℃。

1.2.3 測序 博尚生物公司。

1.2.4 序列比對 應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行。

1.2.5 HPLC 儀器為日本島津公司生產(chǎn)的LC-10AD型高效液相色譜儀，齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品從中國藥品生物制品檢定所購買。分別取4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 μl 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，以峰面積值為橫坐標(biāo)，進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程為：y=0.00287888x-16.1335，r=0.9994724，表明儀器精密度良好。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜種細(xì)胞系中β-amyrin合成酶基因的克隆與序列分析

2.1.1 雜種細(xì)胞系中β-amyrin合成酶基因的克隆 在先前的研究中，已經(jīng)通過RACE方法在麻花艽中獲得了 2 個同源的β-amyrin合成酶基因，將其稱作GsAS1 和GsAS2；在狹葉柴胡中獲得了 1 個 β-amyrin合成酶基因，稱作BsAS。本研究以P1、P2和P3、P4 兩對引物分別在雜種細(xì)胞系ZA、ZB、ZC中進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得了GsAS1 的同源序列GsAS1za、GsAS1zb、GsAS1zc和GsAS2的同源序列GsAS2za、GsAS2zb、GsAS2zc(圖1a,b)，通過序列分析表明，這 6 個基因均編碼β-amyrin合成酶基因。在狹葉柴胡BsAS的多個區(qū)段中設(shè)計引物，對雜種細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)增，均未獲得相應(yīng)的片段，由此可以看出，雜種ZA、ZB、ZC僅表達(dá)了來源于供體麻花艽的GsAS1和GsAS2。

2.1.2 雜種細(xì)胞系中GsAS1和GsAS2的同源性比較 將雜種細(xì)胞系ZA、ZB、ZC中的6個基因序列GsAS1a、GsAS2a、GsAS1b、GsAS2b、GsAS1c、GsAS2zc進(jìn)行分析，其核苷酸同源性為90.24 %，氨基酸序列同源性為90.38 %。其中，GsAS1與GsAS1a、GsAS1b、GsAS1c序列完全相同；GsAS2與GsAS2b序列完全相同，與GsAS2a、GsAS2c不相同，其核苷酸序列同源性分別為99.8 %和99.87 %，氨基酸序列同源性分別為99.87 %和99.80 %。

圖1 體細(xì)胞雜種cDNA中GsAS1(A)和GsAS2(B)基因的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of GsAS1(A)和GsAS2(B) from cDNA in hybrids

IMS: isomultiflorenol合成酶; BAS: β-amyrin 合成酶 (單功能型); MTS:多功能三萜合成酶; LUS:羽扇豆醇合成酶; OSC: 氧化角鯊烯合成酶; CAS: 環(huán)阿屯醇合成酶; MAS: 混合的β-amyrin 合成酶圖2 親本和雜種中β-amyrin合成酶基因的系統(tǒng)樹分析Fig.2 Phylogenetic analysis of β-amyrin synthase in parents and hybrids

2.2 體細(xì)胞雜種中β-amyrin合成酶基因的系統(tǒng)樹分析

為了分析體細(xì)胞雜種中β-amyrin合成酶基因與親本及其它物種中同族基因的親緣關(guān)系，從GenBank中選取了擬南芥、大豆、人參、甘草、白樺、紫菀、北柴胡等植物的β-amyrin合成酶基因、環(huán)阿屯醇合成酶基因、羽扇豆醇合成酶基因等氧化角鯊烯家族基因進(jìn)行系統(tǒng)樹分析。結(jié)果表明：GsAS1及其3個雜種細(xì)胞系最接近擬南芥的LUP2(屬于羽扇豆醇合成酶)，在GsAS1所處的分支上，除剛才提到的LUP2外，其余均為βAS(β-amyrin合成酶)(圖2)，說明GsAS1及其雜種應(yīng)聚類在β-amyrin合成酶中。GsAS2及其3個雜種細(xì)胞系均與人參的OSCPNY2(屬于β-amyrin合成酶)關(guān)系最近，而體細(xì)胞雜種的另一個親本狹葉柴胡的BSAS存在于系統(tǒng)樹的另一β-amyrin合成酶分支上，與綠玉樹最接近，與麻花艽親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 雜種細(xì)胞系中GsAS1和GsAS2的等位變異研究

對親本及其雜種細(xì)胞系的β-amyrin合成酶基因序列進(jìn)行分析，如圖3所示，雜種ZA和ZC的GsAS2 與麻花艽的GsAS2序列存在1～2個堿基的突變(同源性分別為99.3 %和98.6 %)，麻花艽GsAS2 第4位氨基酸(CTG)在雜種ZA和ZC中突變?yōu)镃TA，但CTG和CTA均編碼亮氨酸；384位氨基酸CCA在雜種ZC中突變成CCG，但二者均編碼脯氨酸。這說明在雜種細(xì)胞系中，GsAS2a和GsAS2c雖發(fā)生了不同程度的堿基突變，卻編碼同一種氨基酸，即發(fā)生了無義突變，因此，不影響雜種ZA和ZC中GsAS2的功能。

2.4 雜種細(xì)胞系及親本β-amyrin合成酶基因表達(dá)及下游產(chǎn)物齊墩果酸含量分析

2.4.1 雜種細(xì)胞系及親本β-amyrin合成酶基因表達(dá)分析 利用β-amyrin合成酶基因?qū)﹄s種ZA、ZB、ZC及親本進(jìn)行RT-PCR分析，如圖4所示，雜種ZB和ZC均高于雙親，ZA低于雙親，且ZA低于ZB和ZC。

圖3 GsAS2基因在麻花艽及雜種中的核苷酸序列比較Fig.3 Comparison of nucleotides of GsAS2 in G. straminea and hybrids

圖4 親本及雜種β-amyrin合成酶基因的RT-PCR分析Fig.4 Expression of β-amyrin synthase gene in parents and hybrids by semi-quantitative RT-PCR

圖5 體細(xì)胞雜種及親本齊墩果酸的HPLC分析Fig.5 HPLC analysis of the oleanolic acid in parents and hybrids

2.4.2 雜種細(xì)胞系及親本齊墩果酸含量分析 齊墩果酸含量的HPLC分析表明，體細(xì)胞雜種ZA的齊墩果酸含量均低于雙親，ZB和ZC均高于雙親，其中，ZB的齊墩果酸含量最高，是麻花艽的 2.4 倍，其次是ZC，為麻花艽的1.8 倍(圖5)。綜合圖4～5可以看出，齊墩果酸含量和β-amyrin 合成酶基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)，并且說明ZA和ZC中的堿基突變并沒有影響其下游產(chǎn)物齊墩果酸的含量，也就是說：β-amyrin合成酶中個別基因的突變對該基其功能未造成影響。

3 討 論

前人研究發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞雜交技術(shù)可以實現(xiàn)外源染色體/DNA片段及基因向受體基因組的轉(zhuǎn)移[14-16]。本研究通過分析β-amyrin合成酶基因在麻花艽與狹葉柴胡的3個雜種細(xì)胞系中的存在方式，發(fā)現(xiàn)雜種與麻花艽基因的序列相似性很高，僅在ZA中發(fā)生了1個堿基突變，在ZB中未發(fā)生突變，在ZC中發(fā)生了2個堿基突變。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的變異與3個體細(xì)胞雜種的齊墩果酸含量沒有對應(yīng)關(guān)系，表明，β-amyrin合成酶基因發(fā)生1～2個堿基的無義突變對該基因的功能沒有影響。

另外，在本實驗中，體細(xì)胞雜種中的β-amrin合成酶基因均來源于麻花艽，而未得到來源于柴胡的該基因。其原因可能與柴胡的β-amrin合成酶基因在其愈傷組織培養(yǎng)及體細(xì)胞雜交過程中發(fā)生了丟失，其丟失位點由麻花艽β-amyrin合成酶基因所替代有關(guān)，這還需要進(jìn)行深入探討。

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