小果型西瓜子葉節(jié)離體培養(yǎng)

徐洪國(guó)，宣 楊，仲娟娟，王英學(xué)，祁宏英

（齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 黑龍江齊齊哈爾 161006）

中國(guó)作為西瓜的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的60%以上[1]。隨著人民生活水平的提高，居民家庭結(jié)構(gòu)和飲食習(xí)慣的改變，人們對(duì)外觀靚麗、品質(zhì)優(yōu)良、攜帶方便的小果型西瓜的需求日益增加，小果型西瓜種植面積和種植效益也在逐年增加。但是，西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源缺乏，很多重要的性狀無(wú)法通過(guò)常規(guī)育種方法進(jìn)行改良。因此采用生物技術(shù)手段進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的抗病新品種已成為西瓜遺傳育種研究的熱點(diǎn)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為生物技術(shù)的重要組成部分，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。近年來(lái)西瓜離體培養(yǎng)技術(shù)己經(jīng)被廣泛用于離體快速繁殖[2]、基因的遺傳轉(zhuǎn)化[3-6]和誘導(dǎo)變異[7]等方面。高效組織培養(yǎng)和植株再生技術(shù)的建立是西瓜在生物技術(shù)研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)，西瓜子葉節(jié)無(wú)菌體系一般是通過(guò)種子去殼后在無(wú)菌條件下萌發(fā)而獲得無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗子葉節(jié)誘導(dǎo)不定芽的方法而建立的。

前人已經(jīng)在西瓜組織培養(yǎng)和植株再生方面進(jìn)行了研究，但是，小果型西瓜自交品系K1由于種子較小，胚發(fā)育不良，在組織培養(yǎng)過(guò)程中存在出芽率低、污染率高、子葉節(jié)再生率低等問(wèn)題，為了進(jìn)一步探索小果型西瓜組織培養(yǎng)技術(shù)，以期建立小果型西瓜自交品系K1的組織培養(yǎng)和植株再生流程，筆者系統(tǒng)研究了小果型西瓜種子無(wú)菌萌發(fā)的條件及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)子葉節(jié)再生不定芽的影響，為進(jìn)一步完善西瓜再生體系提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用小果型西瓜自交品系‘K1’為試驗(yàn)材料，西瓜種子由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院園藝試驗(yàn)室提供。試驗(yàn)于2016年7—12月在齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院園藝植物組織培養(yǎng)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子的處理 種子的處理方式如表1：（1）先浸種0、6、12 h 再分別用 0.1%升汞浸泡5、10、15 min；（2）3%（ω，下同）NaClO 浸種20 min后直接培養(yǎng)；（3）3%NaClO 浸種 20 min 后再浸種 6、12 h，然后再用3%NaClO消毒20 min。

表1 種子處理方式

1.2.2 種子的離體萌發(fā) 將西瓜種子去殼消毒后接入不同無(wú)菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。無(wú)菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS，1/2 MS、1/4 MS和 1/8 MS(含庶糖 30%，瓊脂0.9%)。先進(jìn)行3 d的暗培養(yǎng)，之后再進(jìn)行光培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況。

1.2.3 子葉節(jié)外植體的獲取和培養(yǎng) 在無(wú)菌條件下選取苗齡5～7 d的西瓜無(wú)菌苗，切取子葉節(jié)，子葉節(jié)基部插入培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖30%，pH 5.8，用0.9%瓊脂。設(shè)置不同培養(yǎng)基，誘導(dǎo)子葉節(jié)產(chǎn)生不定芽。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)西瓜種子萌發(fā)的影響

由表2可知，用不同的方式處理種子對(duì)種子的萌發(fā)率影響較大，浸種6 h有助于提高種子的萌發(fā)率，在浸種之前對(duì)西瓜種子帶皮進(jìn)行表面消毒處理可以顯著減少污染率。本研究中，小果型西瓜種子最佳浸種及消毒滅菌方式為先用3%NaClO消毒20 min，無(wú)菌水浸種6 h，然后用70%酒精消毒60 s，再用3%NaClO消毒20 min，最后用無(wú)菌水清洗3次每次1 min。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)西瓜種子萌發(fā)的影響

由表3可知，不同培養(yǎng)基對(duì)小果型西瓜種子萌發(fā)的影響很大，雖然西瓜種子在4種培養(yǎng)基上均能萌發(fā)，但在1/8 MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率最高，達(dá)到94.1%，而且萌發(fā)迅速，幼苗生長(zhǎng)健壯。

表2 不同處理對(duì)種子萌發(fā)及污染的影響

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)西瓜種子萌發(fā)的影響

2.3 不同質(zhì)量濃度激素配比對(duì)西瓜子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)的影響

將外植體分別接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，比較不同生長(zhǎng)激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響，其結(jié)果如表4。經(jīng)過(guò)2周時(shí)間左右，絕大部分子葉的切口處都會(huì)生長(zhǎng)出綠色的小芽。由表4可知，這些不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基全部都可以誘導(dǎo)出不定芽，但是其誘導(dǎo)結(jié)果卻大不相同，其中，在MS培養(yǎng)基中附加BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的激素配比的不定芽誘導(dǎo)率在本試驗(yàn)中最高；而其他的激素配比都是不如甚至相差很大。有上述的試驗(yàn)結(jié)果表明，西瓜子葉節(jié)誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中附加 BA2.0 mg·L-1、NAA0.1 mg·L-1。

表4 不同處理對(duì)西瓜子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)的影響

3 討論與結(jié)論

3.1 西瓜無(wú)菌苗的獲得

小果型西瓜由于種子較小，胚發(fā)育不良，含內(nèi)源菌[8]等原因，在組織培養(yǎng)過(guò)程中存在出芽率低、污染率高、種子發(fā)芽不整齊甚至喪失發(fā)芽能力等問(wèn)題較為突出，本試驗(yàn)從多方面研究了小果型西瓜種子浸種與消毒滅菌的影響因素。因?yàn)槲鞴系姆N皮比較堅(jiān)硬[9]，所以要在種子發(fā)芽之前要對(duì)種子進(jìn)行浸泡處理，一般浸泡6 h左右對(duì)發(fā)芽率的提高最有利，在浸種之前對(duì)西瓜種子帶皮進(jìn)行表面消毒處理可以顯著減少污染率，這可能是由于在浸種之前對(duì)種子進(jìn)行表面消毒可以減少外部細(xì)菌的滲入。

3.2 西瓜子葉節(jié)不定芽的誘導(dǎo)

在進(jìn)行西瓜子葉節(jié)的再生培養(yǎng)時(shí)，子葉節(jié)的愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100%，然后從愈傷組織中誘導(dǎo)出不定芽。因此，子葉節(jié)作為外植體可以通過(guò)愈傷組織途徑，誘導(dǎo)愈傷組織后再進(jìn)一步分化形成再生植株。激素是誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定芽的重要因素之一。不同的激素類型和濃度配比對(duì)不定芽影響明顯。很多學(xué)者對(duì)此也進(jìn)行了研究。研究結(jié)果均為一定濃度的6-BA是誘導(dǎo)西瓜外植體分化所必須的激素，附加低濃度的IAA、IBA或者NAA則有利于不定芽的誘導(dǎo)分化，但是不同基因型的西瓜不定芽誘導(dǎo)率存在一定的差異[10-16]。本研究結(jié)果表明，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的組合在促進(jìn)西瓜子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)方面起著重要的作用，從本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，通過(guò)設(shè)置不同的濃度配比最終選擇出最適合誘導(dǎo)西瓜不定芽的激素配比。本研究中當(dāng)BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的配比能使小果型西瓜自交品系‘K1’不定芽的誘導(dǎo)率達(dá)到最高達(dá)到70.1%。

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