病理性瘢痕組織中Bcl-2、Fas蛋白的表達及意義

趙 濱 ， 陰亞坤 ， 李 軻

（1.河南省直第三人民醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州，450000；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州，450000）

瘢痕是促進傷口愈合的生理進程產物，瘢痕纖維組織修復過程中由于創(chuàng)面的不完全張力，可導致瘢痕組織斷裂-再修復的循環(huán)過程，形成病理性瘢痕組織[1]。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，相關研究指出其組織學特點包括成纖維細胞的過度增殖、凋亡受抑制、大量的細胞外基質和膠原纖維排列紊亂等[2]。病理性瘢痕可致使患者皮膚外表美觀度受損，伴有灼痛瘙癢等，并由于攣縮畸形造成功能障礙[3]，深入研究其形成機制對治療病理性瘢痕具有較多積極意義?；诖?，本研究回顧性分析我院行瘢痕切除術患者96例臨床資料，以探究病理性瘢痕組織中B細胞白血病2蛋白（Bcl-2）、自殺相關因子（Fas蛋白）的表達及意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年6月～2017年6月間行瘢痕切除術患者96例臨床資料。納入標準：符合瘢痕切除術指征且于我院行手術者；年齡＞18歲者。排除標準：合并其他皮膚疾病者；精神心理疾病史者；經放射或免疫治療者；病理監(jiān)測結果等臨床資料不完整者。根據切除組織病理檢查結果分為病理性瘢痕組（n=46）和非病理性瘢痕組（n=50）。對照組為非病理性瘢痕組患者正常皮膚組織。病理性瘢痕組：男女分別為28例、18例，年齡22～43歲、平均年齡（26.439.83）歲。非病理性瘢痕組：男女分別為27例、23例，年齡20～39歲、平均年齡（25.799.43）歲。2組一般資料對比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方 法

所有標本均經10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，行連續(xù)切片，一張切片做蘇木精-伊紅（HE）染色，其余做免疫組化染色；均嚴格按照試劑盒說明進行染色。常規(guī)脫蠟后蒸餾水洗5min，置于蒸餾水新鮮配置的3%過氧化氫室溫孵育15min，消除內源性過氧化物酶活性，經蒸餾水洗3次、每次2min，磷酸緩沖鹽溶液浸泡2次、每次5min；將切片進入枸櫞酸鹽緩沖液（PH=6.0），再放入沸騰高壓鍋8min，冷水沖至室溫后孵育30min，蒸餾水洗5min、磷酸緩沖鹽溶液洗2次、每次3min；滴加二抗同種動物血清封閉液，室溫孵育10min，滴加一抗工作液，4℃下過夜，0.01ml磷酸緩沖鹽溶液洗3次、每次5min；滴加即用型生物素標記二抗，置37℃中孵育30min，0.01ml磷酸緩沖鹽溶液洗3次、每次5min；滴加辣根酶標記鏈霉卵蛋白工作液，37℃孵育30min，0.01ml磷酸緩沖鹽溶液洗3次、每次5min；滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間、觀察顯色反應，顯色適度時以蒸餾水終止反應，蘇木素復染30s，蒸餾水水洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗；梯度酒精脫水后，中性樹膠封片。

1.3 評估標準

鏡下觀察切片著色強度及面積進行評分，著色強度0～3分，（0分：無著色、1分：淡黃色、2分：棕黃色、3分：棕褐色），陽性著色面積0～3分（0分：無著色、1分：著色面積＜1/3、2分：著色面積1/3～2/3、3分：著色面積＜2/3），2項之和≥3分為陽性[4]；400倍光鏡下觀察免疫組化結果，每例切片隨機選5個視野，每視野觀察100個細胞，記錄陽性細胞數并測算5個視野的細胞平均陽性率。

1.4 觀察指標

比較3組Bcl-2、Fas蛋白陽性率及平均陽性細胞率，利用pearson相關分析Bcl-2、Fas蛋白的相關性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量數據以（x±s）表示，行t檢驗或單因素方差分析，計數數據以[n(%)]表示，行χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗，線性相關關系分析使用pearson相關分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 3組陽性率對比

Bcl-2陽性率病理性瘢痕組高于非病理性瘢痕組和對照組（P＜0.05）、非病理性瘢痕組高于對照組（P＜0.05），Fas陽性率病理性瘢痕組低于非病理性瘢痕組和對照組（P＜0.05）、非病理性瘢痕組低于對照組（P＜0.05），如表1所示。

2.2 3組平均陽性細胞率對比

Bcl-2平均陽性細胞率高于非病理性瘢痕組和對照組（t=9.982、19.393），非病理性瘢痕組高于對照組（t=12.729），Fas平均陽性細胞率低于非病理性瘢痕組和對照組（t=7.350、24.942）、非病理性瘢痕組低于對照組（t=14.306），如表2制，所示。

2.3 Bcl-2、as蛋白的相關性

pearson相關分析結果顯示，Bcl-2和Fas呈負相關關系（r=-0.684，P=0.000）。

3 討 論

病理性瘢痕的病理基礎是以成纖維細胞為主的細胞成分過度增生和以膠原為主的細胞外基質成分的過度沉積，而成纖維細胞調控增生性瘢痕的形成依賴分泌的多種細胞活性成分[5]。減輕患者的不適感并滿足病理性瘢痕患者的審美需求是合理的，激光治療是目前使用較多的治療手段之一[6]，但治療花費較多、還具有一定風險。目前治療病理性瘢痕的藥物研究主要針對其功能異常的成纖維細胞，通過直接或間接抑制成纖維細胞的增殖、侵襲和膠原合成來阻止疾病進展[7]，因此研究調控成纖維細胞的相關因子具有較多積極意義。

表1 3組陽性率對比[n（%）]

表2 3組平均陽性細胞率對比（xs±，%）

細胞凋亡收到細胞內凋亡調節(jié)蛋白的調控，而凋亡蛋白分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩類，Bcl-2家族在細胞凋亡中起關鍵作用[8]。相關研究發(fā)現，Bcl家族在肥厚性瘢痕生成中也起重要作用[9]。本研究結果顯示，病理性瘢痕組標本中Bcl-2陽性率和平均陽性細胞率顯著高于非病理性瘢痕組和對照組，且非病理性瘢痕組高于對照組，這表明Bcl-2表達上升可在病理性和非病理性瘢痕形成中起作用。Bcl-2細胞表達上升，與Bax蛋白形成二聚體，阻斷細胞色素C釋放，則成纖維細胞凋亡受到抑制[10]，使瘢痕中成纖維細胞過度增殖、膠原蛋白過度累積，促進病理性瘢痕發(fā)生。周曙[11]等學者在其論著中表示，姜黃素可通過調節(jié)Bcl-2/Bax蛋白的表達比例來誘導增生性瘢痕成纖維細胞凋亡，與本文結論相互印證。國外也有學者使用腫瘤壞死因子α刺激基因-6處理病理性瘢痕后發(fā)現，Bcl-2表達水平下降，Bax蛋白上升[12]。

Fas/Fas受體系統(tǒng)介導的信號通路是細胞凋亡的重要途徑之一[13]。Fas受體在正常皮膚及病理性瘢痕成纖維細胞膜上均有分布，本研究結果顯示，Fas蛋白在病理性和非病理瘢痕中陽性率和平均陽性細胞率均低于正常皮膚，即Fas在瘢痕形成中低表達。同時，Bcl-2和Fas蛋白呈負相關關系，說明凋亡途徑和抗凋亡途徑兩者在病理性瘢痕形成機制中均有影響，且兩因子相互關聯，但其具體機制仍需進一步研究。病理性瘢痕相關研究從細胞因子、蛋白組學等領域進行探討[14]，以期從不同層面中分析病理性瘢痕形成機制，為指導臨床治療和藥物研究提供新思路。病理性瘢痕中主要是成纖維細胞和血管內皮細胞，李云飛[15]等學者發(fā)現，病理性瘢痕中血管內皮生長因子等促血管生成細胞生長因子也呈高表達，說明血管內皮細胞增殖也參與病理性瘢痕形成。

本研究雖獲得一定結論，但受觀察時間和樣本量影響仍存在一定局限性。病理性瘢痕組織形成明顯受Bcl-2及Fas蛋白影響，同時也受促血管生長細胞生長因子的影響，因此相關研究者可進一步探究影響病理性瘢痕不同因子間的相關關系，以期進一步找到消除病理性瘢痕的關鍵因素。調節(jié)Bcl-2及Fas蛋白表達水平是消除病理性瘢痕的有效機同時Bcl-2在腫瘤細胞生長和轉移中也起一定作用[16]，相關藥物研究也可以從此入手，以推動臨床新藥研究。

綜上所述，病理性瘢痕中Bcl-2表達水平高于非病理性瘢痕和正常皮膚，Fas蛋白則在病理性瘢痕中低表達。

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