兒童肺泡灌洗液RT-PCR檢測對支原體感染的輔助診斷價值探討

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)作為寄居在呼吸道中的條件致病菌，是介于細(xì)菌和病毒間的一種病原微生物，也是引起兒童非典型性感染的主要病原體[1]。兒童感染后導(dǎo)致的支原體肺炎，病程長，癥狀重[2]，且體征、影像學(xué)檢查缺乏特異性，因此，MP的病原學(xué)檢查對早期診斷和及時治療尤為重要。MP感染一般為自限性，但合并癥的發(fā)生，可威脅患兒生命[3]。通過測定肺泡灌洗液中MP-DNA，可提高M(jìn)P的檢出率[4]。由于MP的潛伏期至少為1周[5]，因此將患兒發(fā)病到入院前的時間作為入院前病程，分為入院前病程≤7 d和>7 d，通過實時熒光定量PCR對肺泡灌洗液MP-DNA的定量檢測，并結(jié)合間接熒光免疫法對靜脈血MP-IgM的定性檢測，探討實時熒光定量PCR對MP感染的輔助診斷價值，以期為臨床診治提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料選取安徽省兒童醫(yī)院2016年1月至12月收治的235例肺炎患兒為研究對象，MP-DNA陽性和/或MP-IgM陽性。患兒中，男患兒138例，女患兒97例；年齡1～14歲；重癥肺炎91例中，包括難治性支原體肺炎3例，大葉性肺炎25例，其余63例肺炎合并胸腔積液、肺膿腫、肝功能損害、肺不張等。重癥性肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《諸福棠實用兒科學(xué)》[6]，分為重癥肺炎(91例)與輕癥肺炎(144例)。1～3歲為幼兒期，>3～14歲為學(xué)齡前期和學(xué)齡期[7]，據(jù)此將患兒分為1～3歲(80例)、>3～14歲(155例)。

1.2研究方法

1.2.1儀器與試劑美國ABI公司7300實時熒光定量PCR儀、美國奧林巴斯公司熒光顯微鏡，試劑盒為湖南圣湘公司MP熒光定量檢測試劑盒、西班牙VIRCELL公司PENUMOSLIDE-IgM呼吸道九聯(lián)檢測試劑盒。

1.2.2實驗方法

1.2.2.1MP-DNA檢測通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測MP-DNA。收集患兒支氣管肺泡灌洗液，取1 mL混勻后的支氣管肺泡灌洗液加入1.5 mL Ep管中，將配置好的反應(yīng)體系加入PCR儀反應(yīng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到拷貝數(shù)。按照試劑盒操作說明，MP-DNA拷貝量<4.00×102copies/mL為陰性，MP-DNA拷貝量≥4.00×102copies/mL為陽性；同時根據(jù)本實驗室前期積累數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計MP-DNA拷貝量中位數(shù)在1.00×105copies/mL，分為低拷貝組(4.00×102～1.00×105copies/mL)、高拷貝組(拷貝量>1.00×105copies/mL)。

1.2.2.2MP-IgM 檢測通過間接熒光免疫法檢測MP-IgM。采集患兒靜脈血2 mL，離心取上清，按照試劑盒操作說明,將最后形成抗原抗體復(fù)合物IgM-FITC在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并根據(jù)試劑盒陽性標(biāo)準(zhǔn)判斷檢測結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)[P50(P25, P75)]表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗,計數(shù)資料以率描述，率的比較采用χ2檢驗， 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同性別MP-DNA及MP-IgM陽性率比較男患兒MP-DNA陽性率為93.48%，女患兒陽性率為92.78%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。男患兒MP-IgM陽性率為37.68%，低于女患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1不同性別患兒MP-DNA及MP-IgM檢測結(jié)果比較[例(%)]

性別例數(shù)MP?DNA(+)MP?IgM(+)男138129(93．48)52(37．68)女9790(92．78)52(53．61)χ2值0．0435．857P值0．8350．016

2.2不同年齡MP-DNA及MP-IgM陽性率比較1～3歲患兒MP-DNA陽性率為87.50%，低于>3～14歲患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；不同年齡患兒的MP-IgM陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2不同年齡患兒MP-DNA及MP-IgM檢測結(jié)果比較[例(%)]

年齡例數(shù)MP?DNA(+)MP?IgM(+)1～3歲8070(87．50)29(36．25)>3～14歲155149(96．13))75(48．39)χ2值6．1923．151P值0．0130．076

2.3不同病程MP-DNA、MP-IgM陽性率比較入院前病程≤7 d患兒MP-DNA陽性率為95.73%，入院前病程>7 d患兒 MP-DNA陽性率為90.68%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)； 入院前病程≤7 d患兒MP-IgM的陽性率為34.19%，低于入院前病程>7 d患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3不同病程患兒MP-DNA及MP-IgM檢測結(jié)果比較[例(%)]

入院前病程例數(shù)MP?DNA(+)MP?IgM(+)≤7d117112(95．73)40(34．19)>7d118107(90．68)64(54．24)χ2值2．3609．573P值0．1240．002

2.4MP-DNA陽性率和拷貝量與病情的關(guān)系重癥肺炎患兒MP-DNA陽性率為95.60%，輕癥肺炎患兒MP-DNA陽性率為91.67%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；重癥肺炎中MP-DNA高拷貝量占85.71%，輕癥肺炎中MP-DNA高拷貝量占65.28%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。重癥肺炎患兒MP-DNA的拷貝量為9.34×106(1.80×106，1.06×108)copies/mL，輕癥肺炎患兒MP-DNA的拷貝量為2.9×106(4.96×104，3.00×107)copies/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.156，P=0.002)。

表5不同病情患兒MP-DNA陽性率及拷貝量檢測結(jié)果比較[例(%)]

肺炎例數(shù)MP?DNA(+)MP?DNA高拷貝量重癥肺炎9187(95．60)78(85．71)輕癥肺炎144132(91．67)94(65．28)χ2值1．36311．869P值0．2430．001

3　討論

MP是兒童呼吸道感染的主要病原體，可發(fā)生在任何季節(jié)[5]，感染后臨床表現(xiàn)不典型，若不及時治療，病情遷延，會增加治療難度[8]；且感染患兒的年齡越小，越容易出現(xiàn)呼吸困難[9]。目前，培養(yǎng)法仍是診斷MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時長。RT-PCR可對MP核酸水平進(jìn)行定量檢測，與培養(yǎng)法及Elisa、間接免疫熒光法比較，干擾因素少，結(jié)果可量化，精準(zhǔn)度更高，已越來越多應(yīng)用于MP的檢測中。

本研究結(jié)果顯示，女患兒血清MP-IgM陽性率高于男患兒，和何雯等[10]報道一致。與趙巖等[11]研究結(jié)果不同的是，本研究中男女患兒MP-DNA的陽性率無明顯差異，這可能與樣本來源、種類不同有關(guān)。本研究>3～14歲患兒MP-DNA陽性率要高于1～3歲患兒，與相關(guān)研究[11]結(jié)果一致，考慮為>3～14歲患兒多處在幼兒園、學(xué)校等人群密集場所[5]，易出現(xiàn)交叉感染，從而造成MP在該年齡段的高檢出率。

本研究還對發(fā)病到入院前不同病程的患兒MP-DNA、MP-IgM陽性率進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示入院前病程≤7 d與入院前病程>7 d患兒的MP-DNA陽性率無明顯差異，與盧志威等[12]報道相似。而入院前病程>7 d患兒的MP-IgM陽性率卻高于≤7 d患兒，可能和MP的潛伏期以及感染后相關(guān)抗體出現(xiàn)的時間有關(guān)。一般MP的潛伏期至少為1周[5]，MP-IgM也在感染后1周左右可檢測到，3～4周達(dá)高峰，2～4個月消失。因此，在入院前病程>7 d的患兒中，更易檢出MP-IgM。

此外，本研究未發(fā)現(xiàn)重癥肺炎和輕癥肺炎患兒MP-DNA的陽性率的明顯差異，一定程度上表明MP-DNA檢出率受病情的影響較小。同時結(jié)果顯示重癥肺炎患兒的MP-DNA的拷貝量要高于輕癥肺炎，這與患兒局部組織高菌量的定植，引發(fā)了強(qiáng)烈的免疫炎性反應(yīng)有關(guān)，提示MP-DNA拷貝量的高低和病情的輕重有一定的關(guān)系。郭飛波等[13]研究發(fā)現(xiàn)，重型支原體肺炎患兒體內(nèi)促炎因子(IL-8、TNF-α)高于輕型患兒，佐證了MP的發(fā)病機(jī)制依賴于感染后引發(fā)的免疫反應(yīng)。

綜上所述，RT-PCR定量檢測MP-DNA與間接免疫熒光法定性檢測MP-IgM抗體相結(jié)合，可提高診斷MP感染的靈敏度，而肺泡灌洗液RT-PCR直接取材于病灶，其拷貝量反應(yīng)了患兒體內(nèi)MP復(fù)制情況，使患兒病情評估得到了量化，有助于臨床開展個體化診療。

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