實(shí)驗(yàn)獼猴B病毒抗體檢測(cè)結(jié)果分析

獼猴別名恒河猴、老青猴、廣西猴等，主要分布在我國(guó)廣東、廣西、云南、貴州等地，獼猴對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)性很強(qiáng)，且易于馴養(yǎng)繁殖。因獼猴在生理上與人類較接近，故是生命科學(xué)研究，尤其是老年醫(yī)學(xué)、神經(jīng)醫(yī)學(xué)和生理學(xué)、心理學(xué)等應(yīng)用較多的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。B病毒又稱猴皰疹病毒1型，獼猴感染B病毒后就像人類感染皰疹病毒一樣，一般只引起局部或者無(wú)癥狀的感染，且能在1～2周內(nèi)自愈。但人類感染B病毒后果較嚴(yán)重，可能會(huì)導(dǎo)致腦炎、腦脊髓膜炎，病情嚴(yán)重可出現(xiàn)呼吸麻痹乃至死亡[1-4]。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)及監(jiān)測(cè)(GB14922.2-2001)要求普通級(jí)獼猴必須排除B病毒[5]。本研究使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)與免疫酶試驗(yàn)對(duì)采集實(shí)驗(yàn)獼猴血清樣本進(jìn)行B病毒抗體檢測(cè)，分析實(shí)驗(yàn)獼猴B病毒抗體陽(yáng)性情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象選取安徽省實(shí)驗(yàn)獼猴中心獼猴400只，雌性獼猴215只(53.75%)，雄性獼猴185只(46.25%)，年齡1～15歲，平均(4.35±2.56)歲，體質(zhì)量2～12 kg，平均(4.08±1.52)kg。每只獼猴均采集靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取血清至2 mL EP管，放置在-30℃冰箱中備用。

1.2檢測(cè)試劑與方法B病毒抗原片及試劑由北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，獼猴B病毒ELISA檢測(cè)試劑盒由廈門慧嘉生物科技有限公司提供。按照GB/T 14926.60-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獼猴皰疹病毒I型(B病毒)檢測(cè)方法、GB/T 14926.50-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及GB/T 14926.51-2001 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫酶試驗(yàn)規(guī)定[6-8]，使用ELISA和免疫酶試驗(yàn)檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.3結(jié)果判定免疫酶試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：正?？乖?xì)胞無(wú)色，滴加陽(yáng)性血清的病毒抗原孔細(xì)胞有顏色反應(yīng)即可判定結(jié)果。待檢血清的病毒抗原孔細(xì)胞無(wú)色判為陰性，呈淺棕色或棕色判為陽(yáng)性。ELISA方法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00，陰性對(duì)照孔平均值≤0.10，試驗(yàn)有效。臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15，樣品光密度(optical density, OD)值<臨界值，為B病毒抗體陰性；樣品OD值≥臨界值，為B病毒抗體陽(yáng)性。本研究結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：ELISA與免疫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性的樣本為陽(yáng)性，否則為陰性。

2　結(jié)果

2.1檢測(cè)結(jié)果免疫酶試驗(yàn)檢測(cè)B病毒抗體陽(yáng)性146份、陰性254份，ELISA檢測(cè)B病毒抗體陽(yáng)性147份、陰性253份。免疫酶試驗(yàn)檢測(cè)B病毒抗體陽(yáng)性率為36.50%，ELISA檢測(cè)結(jié)果B病毒抗體陽(yáng)性率為36.75%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)；Kappa檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法一致性良好(Kappa=0.995，P=0.005)。本研究結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)果顯示，B病毒抗體陽(yáng)性獼猴146只，陰性254只，B病毒抗體陽(yáng)性率為36.50%。見表1。

表1兩種檢測(cè)方法結(jié)果比較(只)

免疫酶試驗(yàn)ELISA陽(yáng)性陰性合計(jì)陽(yáng)性1460146陰性1253254合計(jì)147253400

2.2不同性別實(shí)驗(yàn)獼猴B病毒抗體陽(yáng)性率比較雌性獼猴B病毒抗體陽(yáng)性率為36.74%，雄性獼猴則為36.22%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.012,P=0.913)。見表2。

2.3不同年齡實(shí)驗(yàn)獼猴B病毒抗體陽(yáng)性率比較幼年獼猴(0～2歲)B病毒抗體陽(yáng)性率30.68%，青年獼猴(3～5歲)B病毒抗體陽(yáng)性率32.34%，成年獼猴(6～15歲)B病毒抗體陽(yáng)性率66.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.200,P=0.000)。見表2。

2.4不同體質(zhì)量獼猴B病毒抗體陽(yáng)性率比較低體質(zhì)量獼猴(0～<5 kg)B病毒抗體陽(yáng)性率為30.30%，正常體質(zhì)量獼猴(5～<10 kg)B病毒抗體陽(yáng)性率分別為65.15%，超體質(zhì)量獼猴(10～12 kg)B病毒抗體陽(yáng)性率分別為75.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.402,P=0.000)。見表2。

表2不同性別、年齡和體質(zhì)量獼猴B病毒抗體陽(yáng)性結(jié)果比較

指標(biāo)只數(shù)檢測(cè)結(jié)果(只)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性率(%)χ2值P值性別00120913　雌性215791363674　雄性185671183622年齡262000000　幼年176541223068　青年167541133234　成年5738196667體質(zhì)量314020000　低體質(zhì)量3301002303030　正常體質(zhì)量6643236515　超體質(zhì)量4317500

3　討論

B病毒是以獼猴為自然宿主的病毒中唯一一個(gè)可以感染人類的人獸共患病毒，感染B病毒的獼猴可以通過(guò)親密接觸、抓咬和性交等方式將B病毒傳播給自己的同伴。當(dāng)獼猴自身免疫力低下時(shí)，B病毒就有可能引起較嚴(yán)重的癥狀。B病毒感染是獼猴飼養(yǎng)及科研工作最危險(xiǎn)的職業(yè)暴露，人感染B病毒的后果更為嚴(yán)重，致死率較高[9]。因此，使用獼猴做實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求B病毒抗體必須陰性。

B病毒抗體陽(yáng)性代表獼猴已經(jīng)感染或者曾經(jīng)感過(guò)B病毒，因此，通過(guò)檢測(cè)B病毒抗體能反應(yīng)獼猴B病毒的感染情況。該群獼猴B病毒抗體陽(yáng)性率為36.50%，介于李晉文等[10]報(bào)道的32.6%～37.8%之間，處于較高水平。本研究發(fā)現(xiàn)，雌性獼猴B病毒抗體陽(yáng)性率高于雄性獼猴，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B病毒抗體陽(yáng)性率在幼年、青年、成年獼猴中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，究其原因可能是：①成年獼猴年齡較長(zhǎng)，部分成年獼猴是當(dāng)年從野外抓獲后馴養(yǎng)的，本身B病毒攜帶率較高，而幼年獼猴多是該中心自行繁殖的，出生后與攜帶B病毒的獼猴進(jìn)行了隔離，同時(shí)通過(guò)分欄等方式減少相互抓咬的機(jī)會(huì)，因此B病毒攜帶率較低；②幼年獼猴尚未成熟，性情較青年獼猴和成年獼猴溫順，發(fā)生抓咬的概率較青年、成年獼猴小，同時(shí)發(fā)生性行為的比例很小，減少了B病毒的傳播。

本研究采用的免疫酶試驗(yàn)和ELISA方法是比較成熟的免疫學(xué)方法，靈敏度較好，特異性良好[11]。但是2種檢測(cè)方法也存在一定的缺點(diǎn)，免疫酶試驗(yàn)方法是通過(guò)細(xì)胞的變化來(lái)判定是否感染B病毒，對(duì)觀察者的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)要求較高，結(jié)果判定時(shí)需要有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)人員對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核。ELISA檢測(cè)方法結(jié)果判定簡(jiǎn)單，且對(duì)實(shí)驗(yàn)者要求不高，但國(guó)產(chǎn)的B病毒ELISA檢測(cè)試劑盒質(zhì)量參差不齊，購(gòu)買時(shí)需選擇認(rèn)可度較高的產(chǎn)品。同時(shí)，2種檢測(cè)方法都要嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均符合才能判定結(jié)果，否則需重新實(shí)驗(yàn)。

為減少B病毒在實(shí)驗(yàn)獼猴中的傳播，獲得更多合格的實(shí)驗(yàn)獼猴，建議采取以下措施：①保持飼養(yǎng)場(chǎng)地的清潔、衛(wèi)生，工作人員進(jìn)入飼養(yǎng)場(chǎng)地佩戴口罩、帽子、手套等防護(hù)裝備；②設(shè)置遠(yuǎn)離健康猴群飼養(yǎng)區(qū)的獨(dú)立隔離飼養(yǎng)區(qū)，對(duì)新進(jìn)的獼猴進(jìn)行B病毒抗體檢測(cè)，檢疫合格的獼猴方可進(jìn)入健康飼養(yǎng)區(qū)；③加強(qiáng)獼猴的管理，獼猴按照性別、年齡等合理分籠飼養(yǎng)，減少獼猴之間相互抓咬、攻擊等活動(dòng)。

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