三七提取物抗谷氨酸損傷PC12細胞的活性篩選及成分分析

腦缺血是全世界致殘率和致死率較高的疾病之一，主要發(fā)生于中老年人群[1-2]。前期研究[3-4]表明，腦缺血缺氧后，神經(jīng)細胞的損傷和凋亡與谷氨酸神經(jīng)毒性密切相關(guān)。因此，尋找有效的神經(jīng)保護藥物對缺血性中風的防治具有重要意義。三七為五加科多年生草本植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F .H .Chen 的干燥根，主產(chǎn)于云南、廣西及四川等地，記載于《本草綱目》。三七性溫、味甘，具有活血化瘀、消腫止痛之功效[5]。前期研究[6]多集中于三七水溶性成分對神經(jīng)細胞的保護作用。研究[7]發(fā)現(xiàn)，三七脂溶性成分中含有神經(jīng)保護作用的炔醇類化合物—人參炔醇。鑒于脂溶性成分容易透過血腦屏障，本實驗通過谷氨酸誘導PC12細胞損傷模擬缺血性腦損傷，采用石油醚提取、超臨界CO2萃取三七中的脂溶性成分，并采用MTT比色法篩選出對神經(jīng)細胞保護作用較好的提取物，運用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)鑒定分析三七中脂溶性成分，為深入研究三七脂溶性成分的藥理活性提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗儀器電子天平(JA3003N型，上海精密科學儀器有限公司)；水浴鍋(HH-S2型，江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-6 000型，上海市亞榮生化儀器廠)；純水機(Milli-Q Advantage A10型，美國MILLIPORE公司)；超聲波清洗器(KQ-500DB型，昆山超聲儀器責任有限公司)；超臨界CO2萃取設(shè)備(H L-5L/50 MPa-ⅡCWQ型，浙江省杭州華黎泵業(yè)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(MCO-175 型，日本 Sanyo 公司)；倒置顯微鏡(CK2 型，日本Olympus公司)；凈化工作臺(SW-CJ-1F型，蘇凈集團安泰公司)；酶標儀(ELX800uv 型，美國Bio-Tek公司)；蒸汽消毒鍋(LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠)；烘箱(pHO70A型，上海一恒科技有限公司)。

1.2實驗材料三七粉(購買于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)；石油醚(60～90 ℃，分析純，天津富宇精細化工有限公司)；PC12細胞(新安醫(yī)學教育部重點實驗室凍存)；高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(Gibco進口分裝，武漢生命技術(shù)有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青霉素(80萬單位/支，華北制藥股份有限公司)；鏈霉素(100萬單位/支，華北制藥股份有限公司)；磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；L-谷氨酸(Sigma公司進口分裝)；MTT(Sigma公司進口分裝)；二甲基亞砜(Sigma公司)。

1.3方法

1.3.1石油醚提取三七脂溶性成分稱取三七粉(60目) 20 g， 置索氏提取器中，加入400 mL石油醚，水浴加熱回流至提取液近無色，提取2次，合并提取液并過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚，得淡黃色提取物0.174 g，提取率為0.87%，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2超臨界CO2萃取三七脂溶性成分將三七粉1 000 g投入萃取釜中，對萃取釜、分離釜分別進行加熱，制冷機冷卻。當萃取溫度為48 ℃、分離釜Ⅰ溫度為30 ℃、分離釜Ⅱ溫度為30 ℃時，開啟CO2鋼瓶，通過高壓泵對系統(tǒng)進行加壓。當萃取釜、分離釜Ⅰ、分離釜Ⅱ分別達到30、8、5 MPa時，關(guān)閉CO2鋼瓶，開始循環(huán)，保持恒溫恒壓。當萃取時間達到2 h后，從分離釜Ⅰ、分離釜Ⅱ得到三七超臨界CO2萃取物27.9 g。

1.3.3細胞培養(yǎng)PC12細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d 換液1次，3～4 d傳代1次，選取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.3.4谷氨酸模型的建立將處于對數(shù)生長期的PC12細胞以2×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后細胞完全貼壁，棄去原培養(yǎng)液，換含有不同濃度(分別為5、10、15、20、25、30 mmol/L)谷氨酸的完全培養(yǎng)基(模型組)，對照組不加谷氨酸，每組設(shè)6個復孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24、48、72 h后，MTT比色法檢測細胞存活率，重復實驗3次。按公式計算生長抑制率：抑制率=(1-模型組OD值 /對照組OD值)×100%，根據(jù)半數(shù)抑制率的大小篩選最佳造模濃度和時間。

1.3.5石油醚提取物和超臨界CO2萃取物的安全濃度檢測取處于對數(shù)生長期的PC12細胞，種至96孔板中，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，石油醚提取物和超臨界CO2萃取物分別對倍稀釋終濃度為6.25、12.50、25、50、100、200 μg/mL 6個劑量組。每組設(shè)6個復孔，放置于CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，采用MTT比色法測定490 nm波長處各孔的吸光度值，重復實驗3次。

1.3.6實驗分組取對數(shù)生長期的 PC12 細胞，以2×104個/孔種植于96孔培養(yǎng)板上， 放置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下，24 h貼壁后，更換培養(yǎng)液。隨后分為對照組(不加谷氨酸的正常細胞組)、模型組(谷氨酸損傷的細胞組)、石油醚提取物和超臨界CO2萃取物組(根據(jù)藥物安全濃度篩選再分為25、50、100 μg/mL藥物組)，石油醚提取物和超臨界CO2萃取物預先孵育1 h后，再加谷氨酸共同孵育24 h。

1.3.7MTT比色法檢測細胞活力取對數(shù)生長期的PC12細胞，以2×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后，按1.3.6實驗分組情況進行處理，每組設(shè)6個復孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL的 MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，于恒溫振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀測490 nm 處各孔的吸光度值。細胞存活率(%)=處理組OD值 /對照組OD值×100%，實驗重復3次。

1.3.8GC-MS色譜條件氣相色譜條件：BR-17型毛細管色譜柱 (0.25 μm×250 μm×30 m)；升溫程序：初始溫度50 ℃，恒溫3 min，以每分鐘5 ℃升溫至220 ℃，恒溫3 min，再以每分鐘10 ℃升溫至280 ℃，恒溫8 min；載氣為高純度氦氣；柱流量1.0 mL/min，采用分流進樣，分流比20∶1，進樣量1.0 μL，進樣口溫度260 ℃，溶劑延時3.0 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，電離電壓70 eV，離子源溫度220 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，掃描范圍50～500 m/z。

2　結(jié)果

2.1谷氨酸的細胞毒性作用谷氨酸濃度在5～30 mmol/L時對PC12細胞的生長有明顯的抑制作用，且谷氨酸濃度在25 mmol/L時作用24 h對細胞生長的抑制率接近50%。見圖1。

圖1　谷氨酸對PC12細胞增殖的影響

2.2不同濃度的石油醚提取物和超臨界CO2萃取物對PC12細胞的增殖影響石油醚提取物和超臨界CO2萃取物濃度分別達到200 μg/mL時，明顯抑制PC12細胞的增殖，而濃度為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的石油醚提取物和超臨界CO2萃取物對細胞增殖沒有影響。見表1、表2。

表1　不同濃度石油醚提取物對PC12細胞的增殖影響±s)

注：均與對照組比較

表2　不同濃度超臨界CO2萃取物對PC12細胞的增殖影響±s)

注：均與對照組比較

2.3石油醚提取物和超臨CO2萃取物對谷氨酸誘導的PC12細胞存活率的影響對照組、模型組與不同濃度石油醚提取物組的細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義(F=42.57，P=0.000)。模型組與對照組的細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，25、50、100 μg/mL石油醚提取物組與模型組的細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組、模型組與不同濃度超臨CO2萃取物組的細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義(F=23.41，P=0.000)。模型組與對照組的細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，25、50、100 μg/mL超臨CO2萃取物組與模型組細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。50、100 μg/mL超臨界CO2萃取物組與石油醚提取物組的細胞存活率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。25 mmol/L的谷氨酸作用PC12細胞24 h后，細胞存活率顯著降低，而25、50、100 μg/mL石油醚提取物和超臨CO2萃取物分別預處理PC12細胞1 h后，能顯著提高細胞存活率(P<0.05)。石油醚提取物與超臨CO2萃取物對PC12細胞均有保護作用，但超臨界CO2萃取物具有較好的細胞保護作用(P<0.05)。見圖2。

圖2　不同組別PC12細胞存活率比較

注：與對照組比較，##P<0.05；與模型組比較，**P<0.05；超臨界CO2萃取物組與石油醚提取物組比較，$P<0.05

2.4GC-MS技術(shù)鑒定分析三七提取物按測定條件得到超臨界CO2萃取物和石油醚提取物總離子流色譜圖，見圖3、4。從三七超臨界CO2萃取物中分離出40個峰，鑒定出26種成分，占總組分含量的87.00%；從石油醚提取物中分離出32個峰，鑒定出18種成分，占總組分含量的71.31%。見表3。

圖3超臨界CO2萃取三七脂溶性成分的總離子流色譜圖

圖4石油醚提取三七脂溶性成分的總離子流色譜圖

3　討論

谷氨酸神經(jīng)興奮性毒性在腦缺血疾病中具有重要作用，谷氨酸的過度釋放會導致細胞內(nèi)Ca2+超載，從而引起神經(jīng)細胞凋亡[8]。PC12細胞是大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤分化的細胞株，在形態(tài)和生理上與神經(jīng)細胞極為相似，且具有生長繁殖快、培養(yǎng)周期短、更易控制等特點，是體外研究神經(jīng)元損傷和藥物作用較為理想的細胞[9]。

本實驗采用谷氨酸誘導PC12細胞損傷模型，模擬缺血性腦血管疾病的基本病理過程。藥物安全濃度篩選實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，200 μg/mL的石油醚提取物組和超臨界CO2萃取物組對細胞的活性差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，200 μg/mL的石油醚提取物和超臨界CO2萃取物對細胞的毒性較大，不能作為藥物安全濃度的選擇。6.25～100 μg/mL三七石油醚提取物和超臨界CO2萃取物對PC12細胞增殖具有促進作用， 這與居靖等[7]研究結(jié)果相符合，且超臨界CO2萃取物保護作用效果較好(P<0.05)。另外，采用GC-MS技術(shù)對三七石油醚提取物和超臨界CO2萃取物進行化學成分鑒定分析。三七石油醚提取物和超臨界CO2萃取物中主要的脂溶性成分人參炔醇對損傷的神經(jīng)細胞有保護作用[10]，超臨界CO2萃取物比石油醚提取物保護作用效果好可能與具有神經(jīng)保護作用的脂溶性成分(人參炔醇)的含量有關(guān)，超臨界CO2萃取物中人參炔醇含量(13.09%)是石油醚提取物中人參炔醇含量(4.10%)的3倍。三七主要脂溶性成分人參炔醇及提取物對PC12細胞的具體保護作用機制尚不清楚，需待進一步深入研究。

表3三七提取物GC-MS分析

序號化學成分分子式相對分子質(zhì)量相對含量(%)超臨界CO2萃取物石油醚1桉葉油醇C10H18O1540．27-2Y-欖香烯C15H242040．10-3古蕓烯C15H242040．63-42，5-十八烷二酸甲酯C19H30O22900．311．345大根香葉烯C15H242040．46-6花生四烯酸甲酯C21H34O23180．09-7斯巴醇C15H24O2201．682．308(2E)-2-十二碳烯雙酸C12H20O42280．24-92，2，4-三甲基-3-(3，8，12，16-四甲基十七烷-3，7，11，15-四烯基)-環(huán)己醇C30H52O4280．10-10白檀油烯醇C15H24O2200．17-1110-十七炔基-8-烯酸甲酯C18H30O22780．07-129-己基十七烷C23H483241．52-13棕櫚酸C16H32O22560．86-14乙基-2-(2-甲烷基環(huán)丙基)-反丁烯二酸丙酯C13H18O42381．10-158，11，14-二十碳三烯酸甲酯C21H36O23200．16-163-乙基-5-(2-乙丁基)十八烷C26H543660．160．4917人參炔醇C17H24O24413．094．1018亞油酸C18H32O22803．61-192-[(9Z)-9-十八烯醚基]乙醇C20H40O23120．003-20亞麻精C21H36O43520．72-21(8Z)-7-甲基-8-四烯醋酸酯C17H32O22680．90-22異別膽酸乙酯C26H44O54360．28-23花生酸乙酯C22H44O234058．13-24AO1C23H32O23400．20-25E，E，2-1，3，12-十九碳三炔-5，14-二醇C19H34O22940．65-26反-Z-α-環(huán)氧化紅沒藥烯C15H24O2200．91-27環(huán)氧化-(12)-長葉烯C15H24O220-0．202810-十八烯醛C18H34O266-0．67291，3-十烷二烯C10H14134-0．76305，8-二乙基十二烷C16H34226-0．6131癸酸辛酯C18H36O2284-3．6032反-1，2-二苯基環(huán)丁烷C16H16208-0．4833E-3-十五烯基-2-醇C15H30O226-17．8534二十五碳五烯酸C20H30O2302-1．2035領(lǐng)苯二甲酸正丁酯C16H22O4278-0．26365，7-十二烷二炔-1，12-二醇C12H18O2194-8．9337乙二酸二辛脂C22H42O4370-1．81382-甲基-順-7，8-氧十九烷C20H40O296-1．0139neurosporaxanthinC35H46O2498-1．33401-十六烷基-十九烯C35H70490-6．12

注：-為未測定到的化學成分

[1]尚志紅,云中金,張艷,等.缺血性腦卒中患者血尿酸水平與腦動脈狹窄的相關(guān)性研究[J].安徽醫(yī)學,2014,35(3):294-297.

[2]楊云娜,李彤,孫永全,等.Solitaire AB 支架機械取栓聯(lián)合動脈溶栓治療急性缺血性腦卒中療效觀察[J].安徽醫(yī)學,2015,36(6):669-672.

[3]ZHANG C,TENG F,TU J,et al.Ultrasound-enhanced protective effect of tetramethylpyrazine against cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. PloS One,2014,9(11): e113673.

[4]YANG R,CUI H J,WANG H,et al.N-stearoyltyrosine protects against glutamate-induced oxidative toxicity by an apoptosis-inducing factor (AIF)-mediated caspase-independent cell death pathway[J]. J Pharmacol Sci, 2014, 124(2): 169-179.

[5]謝平安,廖輝.三七對腦神經(jīng)細胞作用機制的研究進展[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2012,33(2): 68-69.

[6]ZHANG C,SHI M,ZHAO G.Ginsenoside Rd protects neurons against glutamate-induced excitotoxicity by inhibiting Ca2+influx[J].Cell Mol Neurobiol,2012,18(1):121-128.

[7]居靖,朱滿洲,汪永忠,等.三七超臨界 CO2萃取物對谷氨酸和一氧化氮引起的PC12細胞損傷的保護作用[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2009,29(2):116-119.

[8]YU L,WANG N,ZHANG Y,et al.Neuroprotective effect of muscone on glutamate-induced apoptosis in PC12 cells via antioxidant and Ca2+antagonism[J].Neurochem Int,2014,70(1):10-21.

[9]王訓翠，朱國旗.丹酚酸B對谷氨酸誘導的PC12細胞興奮毒保護作用的研究[J].中國中藥雜志,2012,37(3):353-357.

[10]段賢春,夏倫祝,汪永忠,等.人參炔醇對氧糖剝奪神經(jīng)細胞損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(16):180-183.