氟對中華圓田螺肝胰臟抗氧化酶活性和MDA含量的影響

陳劍杰，曹謹(jǐn)玲 ，李瀟，陰晴朗

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院生態(tài)畜牧與環(huán)境獸醫(yī)學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太谷 030801

氟元素廣泛分布于自然界，是人和動(dòng)物生長發(fā)育必需的微量元素，然而過量的氟會(huì)對動(dòng)植物產(chǎn)生廣泛的毒性作用[1-3]。水中氟含量過高對人類的毒性效應(yīng)研究已經(jīng)受到高度重視。迄今為止已有大量的研究報(bào)道[4-5]，而水氟對水生動(dòng)物的研究目前比較集中在魚類[6-9]，對貝類的研究還未見報(bào)道。

中華圓田螺(Cipangopaludina cahayensis)俗名田螺、香螺，是我國湖泊、河流、水庫、池塘及稻田等淡水水域中的一種雜食性大型底棲軟體動(dòng)物，直接從底泥中攝食微生物和有機(jī)物等，是多種污染物的生物積累者，在生態(tài)位上占有重要的地位。由于中華田螺在水中營匍匐活動(dòng)，生活環(huán)境相對固定，對水環(huán)境的變化反應(yīng)十分敏感，是監(jiān)測水域污染、評價(jià)水域質(zhì)量最常用的指示生物。因此，利用它作為該試驗(yàn)的受試動(dòng)物可以比較真實(shí)地反映待測定環(huán)境周圍底泥或水體的實(shí)際污染狀況，同時(shí)客觀地評價(jià)當(dāng)?shù)厮蛸|(zhì)量[10]。

本試驗(yàn)以中華圓田螺為受試對象，研究不同濃度氟暴露對其肝胰臟抗氧化酶活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的影響，從而探討氟對田螺毒性效應(yīng)，以期為水質(zhì)污染控制及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用中華圓田螺采自太原市魚種場鯽魚養(yǎng)殖池塘。經(jīng)過10 d馴養(yǎng)期后，選擇體重為(10 ± 1.8) g的健康田螺作為試驗(yàn)材料。

1.1.2主要儀器

電熱恒溫水浴鍋(HW.SY11-K8，北京長風(fēng)儀器儀表公司)；光學(xué)顯微鏡(CX31，日本奧林巴斯)；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(GZX9023，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電子分析天平(AUY120，日本島津公司)；高精度井式馬弗爐(SG-JSL1000，中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所)；氟離子計(jì)檢測儀(PXS-215，上海越磁電子科技有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16R，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；分光光度計(jì)(UV2100，尤尼柯儀器有限公司)。

1.1.3主要試劑

乙醇分析純；高錳酸鉀分析純；氟化鈉(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)分析純；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、過氧化物酶(Peroxidase, POD)試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。

1.2　方法

1.2.1試驗(yàn)分組與染毒

田螺染毒采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法。試驗(yàn)所用水為實(shí)驗(yàn)室曝氣24 h的自來水，經(jīng)測定水質(zhì)滿足漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的要求。根據(jù)文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)試驗(yàn)，在受試田螺不死亡的前提下，試驗(yàn)濃度的選擇應(yīng)該在96 h LC50值的1/2以下，故而濃度分組分別為0、40、80、160 mg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行，每個(gè)平行50枚田螺于體積為(50 cm×35 cm×15 cm)的水族箱中，底部鋪上3 cm厚的細(xì)沙，使細(xì)沙和試液體積比為1:3。期間用充氣泵連續(xù)充氣，每2 d定時(shí)投喂餌料，水溫控制在(26±2) ℃，pH 7.0～8.0，溶解氧3.0～4.0 mg·L-1，總氨0.4 mg·L-1，堿度2.4 mg·L-1。培養(yǎng)期間，上覆水中溶解氧一直保持3.0 mg·L-1以上。自然光照下暴露試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行30 d，期間每5 d換一次水，并徹底清洗水族箱。隔天定時(shí)用離子選擇電極法監(jiān)測水氟含量，保證濃度恒定不變。分別在水氟暴露10 d、20 d和30 d時(shí)各取一次樣。

1.2.2抗氧化酶活性的測定

分別在水氟暴露10 d、20 d和30 d時(shí)，每個(gè)平行組各取7枚田螺。將待測田螺用清水沖洗干凈后，解剖腹足、內(nèi)臟團(tuán)和生殖器官，用天平分別稱重并記錄數(shù)據(jù)、標(biāo)記編號(hào)后，放入烘箱內(nèi)烘干，以備進(jìn)行氟含量測定之用。此外，解剖并于每枚田螺稱取肝胰臟1 g，加入9倍體積的冰浴生理鹽水勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行SOD、GSH、POD 、MDA的測定，所有測定步驟均嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0版軟件進(jìn)行單因素方差分析處理，用GraphPad Prism 5版軟件進(jìn)行作圖。以P < 0.05，P < 0.01表示差異顯著。

2　結(jié)果(Results)

2.1　SOD活性變化

如圖1所示，在整個(gè)水氟暴露染毒過程中，與對照組相比，在10 d處理時(shí)，160 mg·L-1組的SOD活性顯著高于對照組(P<0.01)；暴露20 d時(shí)，相比于對照組，80 mg·L-1組活性顯著升高(P<0.05)，其余2組無明顯變化；暴露30 d時(shí)，與對照組相比，40 mg·L-1

圖1　中華圓田螺肝胰臟組織SOD活性隨處理時(shí)間的變化注：與對照組比較，“* ”為P <0.05，表示差異顯著；“* * ”為P <0.01，表示差異顯著。下同。Fig. 1　The changes of SOD activity in hepatopancreas of Cipangopaludina cahayensis with timeNote: Compared with the control group, "* " for the P <0.05, showing significant difference; "* * " for the P <0.01, showing significant difference; the same below.

圖2　中華圓田螺肝胰臟組織MDA含量隨處理時(shí)間的變化Fig. 2　The changes of MDA content in hepatopancreas of Cipangopaludina cahayensis with time

組活性被抑制，顯著低于對照組(P<0.05)，而160 mg·L-1組活性被顯著誘導(dǎo)(P<0.05)。

2.2　MDA含量變化

在水氟暴露10 d后，與對照組相比，40 mg·L-1組和80 mg·L-1組MDA含量(圖2)顯著升高，而160 mg·L-1組含量被抑制，顯著低于對照組(P<0.01)；暴露20 d后，與對照組相比，40 mg·L-1組含量被誘導(dǎo)，顯著高于對照組(P<0.05)；暴露30 d后，各組MDA含量均低于對照組。

2.3　GSH活性變化

水氟暴露10 d后，與對照組相比，40 mg·L-1組GSH活性(圖3)顯著升高，其余變化不明顯。20 d時(shí)，與對照組相比，GSH活性均顯著升高(P<0.01)，GSH活性達(dá)到最大值30.89 U·mg-1。處理30 d時(shí)，肝胰臟組織GSH活性變化與水氟處理濃度有關(guān)。中高濃度組GSH活性受到抑制比低濃度組更加明顯。40 mg·L-1組在暴露10 d和20 d后，活性均高于其余2組；160 mg·L-1組在暴露10 d時(shí)，活性達(dá)到最低6.097 U·mg-1，且低于對照組水平，以后呈逐漸上升趨勢，在暴露30 d 時(shí)，與對照組相比，40 mg·L-1組和160 mg·L-1組GSH活性顯著升高。

圖3　中華圓田螺肝胰臟組織GSH活性隨處理時(shí)間的變化Fig. 3　The changes of GSH activity in hepatopancreas of Cipangopaludina cahayensis with time

與對照組相比，40 mg·L-1組和160 mg·L-1組GSH活性顯著升高。

2.4　POD活性變化

暴露10 d后，中華圓田螺肝胰臟組織POD活性(圖4)均低于對照組水平，POD活性均受到顯著誘導(dǎo)。在暴露20 d時(shí)，與對照組相比，POD活性均受到誘導(dǎo)而顯著升高(P<0.05)，且160 mg·L-1組達(dá)到最大值39.8 U·mg-1。在暴露30 d時(shí)，與對照組相比，40 mg·L-1組POD活性顯著升高(P<0.05)，80 mg·L-1組和160 mg·L-1組活性受到抑制而顯著降低(P<0.01)，且 80 mg·L-1組達(dá)到最小值18.5 U·mg-1。

3　討論(Discussion)

氟是化學(xué)性質(zhì)極活潑的元素，機(jī)體攝入過量氟后，氟可直接攻擊氧，干擾氧代謝，導(dǎo)致氧自由基增多。同時(shí)氟也可能攻擊構(gòu)成抗氧化酶的微量元素，使抗氧化酶活性下降,同樣導(dǎo)致氧自由基增多[12]，如脂質(zhì)過氧化就是氧自由基攻擊生物膜中多聚不飽和脂肪酸(PUFA)而引起的一系列氧化過程，進(jìn)而對生物體造成一種氧化脅迫狀態(tài)，當(dāng)氧化脅迫超出了生物體抗氧化防御系統(tǒng)的保護(hù)能力時(shí),就會(huì)對生物體造成毒害[13]。

超氧化物歧化酶(SOD)是一種誘導(dǎo)酶，可以催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，清除體內(nèi)過高的超氧陰離子自由基[14-15]，SOD活性可以反映生物體受到環(huán)境氧化脅迫的程度，當(dāng)生物體受到輕度氧化損傷時(shí)，SOD活性往往升高；而當(dāng)受到重度環(huán)境氧化脅迫時(shí)，SOD活性通常降低，使生物體內(nèi)積累過量的活性氧，損害生物體，而在正常情況下，機(jī)體內(nèi)SOD活性和超氧陰離子自由基的含量處于一定的動(dòng)態(tài)平衡中[16-17]。在氟脅迫前20 d時(shí)，中華圓田螺肝胰臟組織中SOD活性在中低濃度暴露下呈現(xiàn)升高，在高濃度暴露下活性降低，這被稱為是“毒性興奮效應(yīng)”，即機(jī)體在低濃度毒性下受到誘導(dǎo)，在高濃度毒性下受到抑制而發(fā)生一定機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，對于機(jī)體的保護(hù)有非常重要的作用。當(dāng)暴露30 d后，低濃度組SOD活力低于對照組，表明組織中抗氧化系統(tǒng)清除多余自由基的能力慢慢下降，組織受到損傷。而高濃度組活性隨著脅迫時(shí)間的升高，這可能由于高毒導(dǎo)致了中華圓田螺的閉殼肌和厴的應(yīng)激閉鎖，致使高毒作用不明顯，而使得抗氧化系統(tǒng)對于自由基的清除作用相對明顯地表現(xiàn)出來，即SOD活性高于對照組[18]。

丙二醛(MDA)是自由基引發(fā)脂質(zhì)產(chǎn)生一系列過氧化作用的分解產(chǎn)物，可以直接反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度[19]。在氟脅迫初期，與對照組相比，中華圓田螺肝胰臟組織中MDA含量在低、中濃度組暴露下升高，高濃度組MDA含量降低。在氟脅迫中期，低濃度組顯著升高，中、高濃度組無顯著差異，說明低濃度組MDA對于氟脅迫的響應(yīng)更加顯著，產(chǎn)生的大量氧自由基引起膜脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致MDA含量顯著升高。當(dāng)氟脅迫達(dá)30 d時(shí)，3個(gè)濃度組均有顯著抑制效應(yīng)，可能是由于隨著氟對機(jī)體脅迫時(shí)間的延長，機(jī)體產(chǎn)生了相應(yīng)的適應(yīng)機(jī)制，從而促使抗氧化防御系統(tǒng)迅速清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基，導(dǎo)致MDA含量降低。這與黃志斐等[16]對于翡翠貽貝的研究結(jié)果相似。

GSH是動(dòng)物體內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，它既可以作為谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)的底物，通過這2種酶起解毒作用，又可直接參與動(dòng)物體內(nèi)親電化合物的清除起解毒作用，在動(dòng)物體內(nèi)解毒代謝中具有重要作用[20]。正常情況下，GSH在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，把H2O2還原為H2O，其自身被氧化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSSG受到谷胱甘肽還原酶的催化作用，接受H還原成GSH，使體內(nèi)自由基的清除反應(yīng)能夠持續(xù)進(jìn)行[21-22]。在水氟脅迫初期，中華圓田螺肝胰臟組織中GSH活性均被誘導(dǎo)，其誘導(dǎo)程度與暴露氟濃度成負(fù)相關(guān)，在暴露中后期，GSH活性依然表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)而使活性呈升高趨勢，這可能是機(jī)體通過應(yīng)激反應(yīng)而使得其GSH含量在短時(shí)間內(nèi)升高，從而消除體內(nèi)富含的活性氧自由基，因此數(shù)據(jù)分析表現(xiàn)出GSH活性不同程度均顯著升高的現(xiàn)象[17]，預(yù)測該現(xiàn)象持續(xù)一段時(shí)間后將會(huì)出現(xiàn)顯著降低的趨勢。這與魯雙慶等[18]的研究結(jié)果相似。另外也可能是中華圓田螺在高毒侵害作用下導(dǎo)致的閉殼肌和厴的應(yīng)激閉鎖，致使高毒作用反而不明顯，而使得抗氧化系統(tǒng)還在發(fā)揮清除自由基的作用。

過氧化物酶(POD)是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要保護(hù)酶，它們能在一定程度上清除活性氧自由基，維持膜系統(tǒng)的穩(wěn)定，降低氧化脅迫對細(xì)胞的傷害程度[23-24]。在整個(gè)水氟環(huán)境暴露過程中，中華圓田螺肝胰臟組織中的POD活性呈現(xiàn)出“抑制-誘導(dǎo)-抑制”的變化趨勢，這可能是因?yàn)椋弘S著暴露時(shí)間的增加，POD不斷被消耗，致使水氟暴露達(dá)到30 d時(shí)，POD活性呈下降趨勢[25]。在暴露初期，中華圓田螺肝胰臟組織POD活性均受到抑制，且低于對照組水平，表明中華圓田螺在水氟暴露下，體內(nèi)的抗氧化防御平衡系統(tǒng)遭到破壞，POD活性被抑制，導(dǎo)致細(xì)胞衰老加快。在處理中期，POD活性由于受到誘導(dǎo)而高于對照組水平，且160 mg·L-1組被誘導(dǎo)作用最為顯著，表明隨著肝胰臟內(nèi)超氧陰離子自由基的升高，POD活性受到應(yīng)激而含量顯著提高，加強(qiáng)清除體內(nèi)多余H2O2的能力，避免機(jī)體受到更多的氧化損傷和毒害，使得細(xì)胞衰老減緩。而且研究表明：該時(shí)期肝胰臟受到的水氟脅迫程度越深，POD活性越高。當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到30 d時(shí)，除40 mg·L-1組無明顯變化外，其余組均表現(xiàn)為顯著降低，且遠(yuǎn)低于對照組水平，說明中高濃度組氟脅迫已經(jīng)對組織抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，打破了已產(chǎn)生的POD和消除H2O2的平衡體系，使POD的消除能力低于組織內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生能力，POD活性急劇下降，不足以消除氟對組織的干擾，從而導(dǎo)致肝胰臟受到氧化損傷。而低濃度組受到的脅迫很輕微，POD氧化平衡體系依舊處于正常狀態(tài)，隨著時(shí)間發(fā)展，預(yù)測一段時(shí)間后POD活性會(huì)向同期中高濃度組所表現(xiàn)出來的趨勢發(fā)展。

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從這些遞進(jìn)的政策可以看出，我國少數(shù)民族高等教育的范圍在不斷擴(kuò)大，不僅提出了發(fā)展少數(shù)民族高等師范教育，也十分重視少數(shù)民族職業(yè)教育的發(fā)展，同時(shí)，為了提高少數(shù)民族干部的文化知識(shí)水平，還制定專門政策大力提倡和發(fā)展少數(shù)民族成人高等教育，為我國少數(shù)民族高等教育發(fā)展做出了前瞻性的指導(dǎo)，有其深刻的意義和內(nèi)涵。

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