碲化鎘量子點(CdTe QDs)對肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)及線粒體介導(dǎo)的毒性機制研究

陸杰，姚影，汪巖，臧一騰，瞿靖，何克宇，吳添舒，梁雪，魏婷婷，熊麗林，張婷,#，唐萌,*

1. 環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；蘇州納米科技協(xié)同創(chuàng)新中心，南京210009 2. 江蘇省生物材料與器件重點實驗室，東南大學(xué)，南京210009

量子點(quantum dots, QDs)是由Ⅲ～Ⅴ族或Ⅱ～Ⅵ族元素組成的一種核-殼結(jié)構(gòu)的納米材料，直徑為2～10 nm，有獨特的熒光特性[1-2]。QDs種類繁多，包括碲化鎘量子點(CdTe QDs)、硒化鎘量子點(CdSe QDs)、石墨烯量子點(graphene quantum dots, GOD)和磷化銦量子點(InP QDs)等[3-5]，其中最為常見的是CdTe/Se QDs。CdTe QDs因具有激發(fā)光波段范圍寬、發(fā)射光譜寬度窄、較傳統(tǒng)有機熒光染料熒光強度大、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在熒光探針、靶向治療、醫(yī)學(xué)診斷等方面有著廣泛應(yīng)用[6]。CdTe QDs具備醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力的同時，其生物安全性評價也越來越受到關(guān)注。

在生產(chǎn)、實驗及醫(yī)療過程中，QDs可能通過皮膚、消化道和靜脈等多種途徑進(jìn)入生物體。相關(guān)研究均表明，不同暴露方式下，QDs 進(jìn)入大鼠或小鼠體內(nèi)后，在動物的主要器官，如心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦中都可以檢測到一定劑量的QDs，尤其在肝臟、腎臟和脾臟中半衰期較長，可達(dá)2年之久[7-11]。Ye等[12]以恒河猴為模型，研究了QDs在靈長類動物體內(nèi)分布，實驗證明QDs 主要富集在肝、脾、腎臟中(總計占到染毒劑量的99%)，含量分別是染毒劑量的35%、58%和6%。體外毒性研究結(jié)果均顯示：CdTe QDs可以對多種來源的細(xì)胞系造成不同程度的損傷，如造成細(xì)胞增殖率下降、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等[13]。

肝臟作為生物體最重要的代謝器官，在生物體內(nèi)起著去氧化、儲存肝糖、分泌性蛋白質(zhì)的合成等作用，當(dāng)QDs等進(jìn)入生物體后在肝臟中大量蓄積，因此研究QDs對肝臟的毒性作用對全面認(rèn)識和評估其毒性顯得尤為重要。目前已有關(guān)于CdTe QDs肝毒性研究報道，Zhang等[11]以小鼠正常肝細(xì)胞(AML12細(xì)胞)為研究對象，染毒MPA-CdTe QDs后，具有劑量和尺寸依賴性的細(xì)胞毒性，細(xì)胞凋亡為主要毒性表現(xiàn)。Nguyen等[14]以HepG2細(xì)胞為研究對象，CdTe QDs染毒后，通過死亡受體途徑和線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Lu等[15]將CdSe/ZnS QDs作用于人正常肝細(xì)胞(L02)細(xì)胞后，除了引起細(xì)胞凋亡外，還通過激活NLRP3炎性小體，導(dǎo)致Caspase-1的激活和白介素1β(IL-1β)的分泌，最終引起細(xì)胞焦亡(pyroptosis)。關(guān)于CdTe QDs引起肝細(xì)胞損傷的機制研究目前仍處于探索階段，還需要進(jìn)一步研究。

本研究采用人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)和人正常肝細(xì)胞(L02細(xì)胞)2種不同類型的肝細(xì)胞作為體外模型評價CdTe QDs的肝毒性作用和潛在的機制，探討CdTe QDs對不同肝細(xì)胞的毒作用和有關(guān)機制，為更全面地進(jìn)行CdTe QDs的安全性評估提供一定科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　實驗細(xì)胞

L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

1.2　實驗試劑和儀器

實驗所用3-巰基丙酸包被的碲化鎘量子點(MPA-CdTe QDs)根據(jù)詹慶玲等[16]提供的方法自行合成。合成量子點后，實驗前按照CdTe QDs：丙酮為1:2(V:V)的比例混合，以15 000 r·min-1離心(離心半徑為8.3 cm)20 min，離心2次后，用完全培養(yǎng)基配成一定濃度的儲備液備用，經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾除菌，于4 ℃冰箱中存放，使用前超聲分散。

磷酸鹽緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；胎牛血清(杭州四季青公司，中國)；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)(Hyclone 公司，美國)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% 的胰蛋白酶溶液(Biosharp 公司，中國)；二甲基亞砜(中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國)；CCK-8試劑、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、活性氧(ROS)檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒，均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(江蘇省凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國)；3-巰基丙酸(MPA，美國Sigma 公司)，CdCl2·2.5H2O、氫氧化鈉、高純氮氣(>99.99%)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Series8000系列-3423 型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific 公司)，CK40-F200 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，MRX全自動酶標(biāo)儀(美國Dynex Technologies公司)，TDZ6B-WS 離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)，BS210S 電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，KQ2200E 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SW-CJ-2F 凈化工作臺(中國蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞術(shù)測定儀(BD 公司，型號：FACS CantoTM)；Zetasizer Nano-ZS90 型Malvern 粒度分析儀(馬爾文儀器有限公司，英國)。

1.3　材料表征

利用馬爾文激光粒度儀測定CdTe QDs在完全培養(yǎng)基中的水合粒徑；利用熒光分光光度計測定CdTe QDs的最大吸收波長和最大發(fā)射波長。

1.4　細(xì)胞培養(yǎng)

L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，體積分?jǐn)?shù)為1%的雙抗)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每日用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.5　細(xì)胞CCK-8試驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞種于96孔板中，每孔5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，加入濃度為0，25，50和100 μmol·L-1的染毒液，每個染毒組設(shè)置5個復(fù)孔。染毒24 h后，棄去染毒液，加入含體積分?jǐn)?shù)10%的CCK-8完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，在酶標(biāo)儀上490 nm處測定吸光度。

1.6　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取對數(shù)生長期細(xì)胞種于6孔板中，每孔種2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為0，25，50和100 μmol·L-1的染毒液，染毒24 h。染毒結(jié)束后在生物圖像導(dǎo)航儀上進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.7　LDH釋放檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞種于96孔板中，每孔5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，加入濃度為0，25，50和100 μmol·L-1的染毒液，染毒24 h。染毒結(jié)束后收集染毒液，根據(jù)試劑盒上試驗步驟進(jìn)行LDH的釋放檢測。

1.8　細(xì)胞對CdTe QDs的攝入情況測定

取對數(shù)生長期細(xì)胞種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，加入濃度為0，25，50和100 μmol·L-1的染毒液，染毒1 h、2 h、4 h、8 h和24 h。染毒結(jié)束后，胰酶消化收集細(xì)胞，并計數(shù)。將收集的細(xì)胞置于15 mL離心管中，加入1 mL濃硝酸硝化過夜，以充分裂解細(xì)胞。硝化結(jié)束后每管加入2 mL過氧化氫，并轉(zhuǎn)移至燒杯中，放在電熱板上進(jìn)行加熱趕酸，待燒杯中殘留的液體剛好覆蓋燒杯底部時停止加熱，加入2%的稀硝酸2 mL，并將液體轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，并用2%稀硝酸定容至5 mL，抽濾。最后在石墨爐上進(jìn)行鎘元素含量的測定，間接反映細(xì)胞對CdTe QDs的攝入情況。

1.9　ROS含量測定

取對數(shù)生長期細(xì)胞種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為0，25，50和100 μmol·L-1的染毒液，染毒24 h。染毒結(jié)束后按照1:2 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為5 μmol·L-1。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無PBS洗滌細(xì)胞2次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。使用488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，在流式細(xì)胞儀上檢測染毒前后熒光強度的變化。

1.10　細(xì)胞凋亡測定

取對數(shù)生長期細(xì)胞種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入染毒液，染毒濃度為0，25，50和100 μmol·L-1，染毒24 h。染毒結(jié)束后，棄去染毒液，用PBS洗2遍，加入無EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 r·min-1，5 min)。加入500 μL Binding Buffer，充分混勻細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后再加入5 μL混勻后Propidium Iodide，混勻，在流式細(xì)胞儀上檢測染毒前后熒光強度的變化。

1.11　ATP含量檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為0，25，50和100 μmol·L-1的染毒液，染毒24 h。設(shè)置0、0.05、0.1、0.5、1、5和10 μmol·L-1等濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸除染毒液，按照6孔板每孔加入200 μL裂解液的比例(即相當(dāng)于細(xì)胞培養(yǎng)液量2 mL的1/10)加入裂解液，裂解細(xì)胞。再根據(jù)試劑盒說明書配制ATP檢測工作液，加100 μL ATP檢測工作液到檢測孔或檢測管內(nèi)。室溫放置3～5 min，以使本底性的ATP全部被消耗掉，從而降低本底值。在檢測孔或檢測管內(nèi)加上20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，用化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出ATP含量。

1.12　細(xì)胞線粒體膜電位檢測

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想熒光探針?？梢詸z測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。取對數(shù)生長期細(xì)胞種于6孔板中，每孔2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入濃度為0，25，50和100 μmol·L-1的染毒液，染毒24 h。染毒結(jié)束后，收集細(xì)胞，用0.5 mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再加入0.5 mL JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。37 ℃孵育結(jié)束后，600 g、4 ℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次(600 g、4 ℃離心3～4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清。)再用適量JC-1染色緩沖液(1×)重懸后，在流式細(xì)胞儀上檢測染毒前后熒光強度的變化。

1.13　統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPPS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著意義。

2　結(jié)果(Results)

2.1　材料表征結(jié)果

如圖1所示，熒光分光光度計測得MPA-CdTe QDs的最大激發(fā)波長為300 nm，最大發(fā)射波長為555 nm。采用馬爾文激光粒度儀測得CdTe QDs在DMEM完全培養(yǎng)基中的水合粒徑和zeta電位的結(jié)果，水合粒徑和zeta電位分別為(31.93±3.92) nm和-(6.62±0.49) mV。

2.2　細(xì)胞毒性試驗結(jié)果

細(xì)胞毒性試驗結(jié)果包括細(xì)胞活性測定、LDH釋放檢測和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。細(xì)胞活性試驗結(jié)果如圖2 所示，與對照組相比，染毒組細(xì)胞的生存率隨著染毒濃度的升高顯著降低(P<0.05)，且具有效應(yīng)-劑量依賴性關(guān)系。QDs染毒24 h后，L02細(xì)胞活力低于HepG2細(xì)胞，說明CdTe QDs對L02細(xì)胞的毒性大于HepG2細(xì)胞。

CdTe QDs染毒細(xì)胞24 h后，觀察2種細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，如圖3 (A和B)所示，對照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞之間緊密連接，細(xì)胞堆積生長；染毒組細(xì)胞的形態(tài)則發(fā)生明顯改變，在最低濃度組(25 μmol·L-1)，部分細(xì)胞開始出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞變圓，細(xì)胞之間連接減少，隨著染毒劑量的增大，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞連接被破壞，異常形態(tài)細(xì)胞增多。

細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細(xì)胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液中，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通過檢測從質(zhì)膜破裂的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH活性，可以實現(xiàn)對細(xì)胞毒性的分析。CdTe QD染毒2種肝細(xì)胞24 h后，檢測LDH的釋放情況，結(jié)果表明，與對照組相比，染毒組染毒液中LDH含量顯著升高(P<0.05)，且具有劑量依賴性，同一染毒劑量下，L02細(xì)胞染毒液中LDH含量要高于HepG2細(xì)胞。

圖1　碲化鎘量子點的最大激發(fā)波長Fig. 1　The maximum emission wavelength of cadmium telluride quantum dots

2.3　細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

凋亡是細(xì)胞死亡形式之一，當(dāng)細(xì)胞受到有害因素作用，是在一系列基因的調(diào)控下細(xì)胞程序性死亡的過程。此過程涉及多個基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控作用，細(xì)胞凋亡對維持機體的穩(wěn)態(tài)和胚胎發(fā)育必不可少。如圖5所示，CdTe QDs染毒2種細(xì)胞24 h后，凋亡細(xì)胞逐漸增多，并且具有劑量依賴性關(guān)系。

2.4　細(xì)胞對 CdTe QDs攝入情況檢測

本研究利用石墨爐法檢測染毒不同濃度和時間后2種細(xì)胞內(nèi)鎘元素的含量，間接反應(yīng)2種細(xì)胞對CdTe QDs的攝入情況。結(jié)果如圖6所示，隨著染毒時間的延長，細(xì)胞內(nèi)鎘含量顯著增多，這與細(xì)胞活力的結(jié)果相一致，說明QDs引起2種肝細(xì)胞活力的降低與細(xì)胞對CdTe QDs的攝取相關(guān)。同樣染毒劑量和時間下，L02細(xì)胞內(nèi)鎘含量顯著高于HepG2細(xì)胞內(nèi)鎘含量。

2.5　ROS含量檢測結(jié)果

正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞生理代謝過程中會產(chǎn)生少量的ROS，適量的ROS對維持細(xì)胞正常的生理功能具有重要作用。但是當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時，細(xì)胞內(nèi)ROS會明顯升高，過量的ROS會造成氧化應(yīng)激，產(chǎn)生氧化損傷。CdTe QD染毒2種肝細(xì)胞24 h

后，細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測結(jié)果如圖7所示，染毒24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS顯著升高，且具有劑量依賴性關(guān)系。

2.6　線粒體功能檢測

線粒體是細(xì)胞能量代謝的主要場所，對維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定也具有重要作用。當(dāng)線粒體受到損傷時，細(xì)胞的氧化呼吸過程被破壞，會誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如圖8所示，CdTe QDs染毒細(xì)胞24 h后，2種細(xì)胞線粒體膜電位都出現(xiàn)不同程度的下降，并隨著染毒劑量的增大，線粒體膜電位下降的細(xì)胞比率增多，2種細(xì)胞之間比較發(fā)現(xiàn)，CdTe QDs對L02細(xì)胞線粒體膜電位影響更明顯。同時對細(xì)胞ATP含量進(jìn)行檢測，如圖8所示，隨著染毒劑量的增大，細(xì)胞ATP含量顯著降低，并且L02細(xì)胞ATP含量的降低比HepG2細(xì)胞更為顯著，這一結(jié)果與線粒體膜電位的結(jié)果一致。

圖2　CCK-8法檢測CdTe QDs對HepG2和L02細(xì)胞生存率的影響注：*P<0.05表示與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fig. 2　Effect of CdTe QDs on HepG2 and L02 cell survival by CCK-8Note: *P<0.05, compared with normal control group.

圖3　CdTe QDs對HepG2(A)和L02(B)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響注：*P<0.05,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fig. 3　Effect of CdTe QDs on HepG2 and L02 cell morphologyNote: A, HepG2 cell; B, L02 cell. P<0.05, compared with control group.

圖4　CdTe QDs對HepG2和L02細(xì)胞的LDH釋放檢測試驗注：*P<0.05,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fig. 4　Effect of CdTe QDs on HepG2 and L02 cell LDH releaseNote: *P<0.05, compared with normal control group.

圖5　FITC/PI法檢測CdTe QDs對HepG2和L02細(xì)胞凋亡率的影響注：*P<0.05,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fig. 5　Effect of CdTe QDs on HepG2 and L02 cell apoptosis by FITC/PI assaysNote:*P<0.05, compared with normal control group.

圖6　2種肝細(xì)胞內(nèi)鎘離子濃度注： 2種肝細(xì)胞CdTe QDs染毒濃度為0～100 μmol·L-1，染毒1、2、4、8和24 h；*P<0.05, 與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。A，HepG2 cell；B, L02 cell。Fig. 6　The concentration determination of cadmium in both liver cellsNote: Both liver cells were treated with 0-100 μmol·L-1 CdTe QDs for 1, 2, 4, 8 and 24 h. *P<0.05, compared with normal control group. A, HepG2 cell; B, L02 cell.

3　討論(Discussion)

CdTe QDs本身具有良好的熒光特性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景，可用于疾病診斷等[17]。肝臟是機體最為重要的代謝器官，也是CdTe QDs體內(nèi)蓄積的主要器官之一，但是對肝臟的毒性作用研究結(jié)果并不一致[18-20]。Lin等[18]的研究表明，CdTe/Se QDs進(jìn)入生物體內(nèi)會蓄積于肝臟中，雖未引起明顯的組織病理學(xué)改變，但是引起肝臟中某些微量元素的改變，抗氧化酶活性的升高等。Wang等[19]研究了CdTe QDs染毒ICR小鼠后引起小鼠肝臟明顯的組織學(xué)改變，金屬硫蛋白表達(dá)升高，肝細(xì)胞凋亡等毒性作用。但是，F(xiàn)an等[20]的研究表明CdTe /CdS QDs進(jìn)入小鼠體內(nèi)后只引起肝細(xì)胞自噬的發(fā)生而未引起細(xì)胞凋亡。體外肝細(xì)胞毒性研究表明，CdTe QDs能夠造成HepG2細(xì)胞、AML12細(xì)胞等肝細(xì)胞生存率降低，細(xì)胞凋亡的發(fā)生等毒作用[11-14]。但是研究使用的CdTe QDs理化性質(zhì)各異，研究結(jié)果也有矛盾之處，因此CdTe QDs的肝毒性機制研究仍需要進(jìn)一步探討。

圖7　CdTe QDs誘導(dǎo)HepG2和L02細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測注：*P<0.05, 與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fig. 7　CdTe QDs induced ROS in HepG2 and L02 cellNote: *P<0.05, compared with normal control group.

圖8　JC-1法測定CdTe QDs對HepG2和L02細(xì)胞線粒體膜電位的影響注： *P<0.05,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fig. 8　Effect of CdTe QDs on HepG2 and L02 cell mitochondrial membrane potential (MMP) by JC-1 assaysNote: *P<0.05, compared with normal control group.

圖9　2種肝細(xì)胞ATP含量檢測注：*P<0.05,與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Fig. 9　The content determination of ATP in both liver cellsNote: *P<0.05, compared with normal control group.

本研究以HepG2和L02細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，探討CdTe QDs對不同類型肝細(xì)胞的毒性及其可能的毒作用機制，為CdTe QDs的安全性評價提供一定的依據(jù)。CdTe QDs染毒24 h后引起2種肝細(xì)胞生存率降低，同等劑量下，CdTe QDs對L02細(xì)胞的損傷比肝癌細(xì)胞更嚴(yán)重。細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡率顯著升高，L02細(xì)胞的凋亡率顯著高于HepG2細(xì)胞，尤其在中高劑量組，L02細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)高于HepG2細(xì)胞，這一結(jié)果與細(xì)胞生存率結(jié)果一致，進(jìn)一步說明CdTe QDs對正常肝細(xì)胞的毒性要大于肝癌細(xì)胞，且CdTe QDs引起細(xì)胞死亡的形式以細(xì)胞凋亡為主。

已有的研究表明，CdTe QDs對細(xì)胞的毒性與CdTe QDs中鎘離子的釋放和其本身的尺寸效應(yīng)相關(guān)[21-22]。鎘離子作為重金屬離子，其可對細(xì)胞直接產(chǎn)生毒性作用[21-23]，同時被細(xì)胞攝取的CdTe QDs進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，破壞細(xì)胞正常生物學(xué)過程最終誘發(fā)細(xì)胞死亡[24]。本次研究利用石墨爐法檢測細(xì)胞內(nèi)鎘元素含量，間接反映細(xì)胞內(nèi)CdTe QDs的含量。結(jié)果顯示，同等染毒時間和染毒劑量情況下，L02細(xì)胞內(nèi)鎘元素含量較HepG2細(xì)胞高,說明L02細(xì)胞對CdTe QDs攝取更多，這也是CdTe QDs導(dǎo)致L02損傷更為嚴(yán)重的原因之一。同時，造成2種肝細(xì)胞對CdTe QDs差異性攝入以及攝入QDs后在細(xì)胞內(nèi)的分布與代謝也需要進(jìn)一步研究，有助于闡明QDs的毒性機制。

除鎘離子釋放外，ROS的過量生成在納米材料誘導(dǎo)細(xì)胞損傷中扮演重要角色，ROS與細(xì)胞內(nèi)的大分子結(jié)合，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，影響細(xì)胞生物學(xué)功能，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。Paesano等[25]研究發(fā)現(xiàn)，CdS QD可造成HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，誘導(dǎo)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。Nguyena等[14]的研究結(jié)果也表明CdTe-QDs可引起HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，導(dǎo)致還原性谷胱甘肽的耗竭，還原性谷胱甘肽與氧化性谷胱甘肽比值降低，最終引發(fā)死亡受體和線粒體途徑介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡。李艷博等[26]研究發(fā)現(xiàn)，巰基乙酸(TGA)包被的CdTe QDs可導(dǎo)致人肝細(xì)胞(HL-7702)細(xì)胞ROS水平升高，誘發(fā)DNA損傷和細(xì)胞周期阻滯。在本研究中，CdTe QDs染毒24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著升高，誘發(fā)細(xì)胞氧化應(yīng)激，且L02細(xì)胞內(nèi)ROS含量比HepG2更多，這結(jié)果與細(xì)胞活性和凋亡率結(jié)果一致，結(jié)合細(xì)胞攝取的結(jié)果，提示我們被攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CdTe QDs引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的明顯升高，誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷。進(jìn)一步檢測線粒體功能發(fā)現(xiàn)，CdTe QDs能夠造成肝細(xì)胞線粒體膜電位的降低和ATP含量的減少，且具有劑量依賴性關(guān)系，說明CdTe QDs誘發(fā)過量的ROS生成后，CdTe QDs引發(fā)線粒體損傷，破壞線粒體正常的氧化呼吸過程，影響了細(xì)胞的生物學(xué)功能，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。如Nguyen等[27]探討了CdTe-QD對HepG2細(xì)胞線粒體損傷，發(fā)現(xiàn)CdTe QDs造成HepG2細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，損害了氧化呼吸過程，降低三磷酸腺苷的含量，過氧化物酶體增殖物激活受體-c共激活劑水平(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator)顯著升高，表明CdTe QDs影響了線粒體的生物合成功能。

綜上所述，CdTe QDs對2種不同類型的HepG2和L02細(xì)胞均可造成損傷，降低細(xì)胞生存率，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。2種肝細(xì)胞之間的比較發(fā)現(xiàn)CdTe QDs對L02細(xì)胞的毒性作用大于HepG2細(xì)胞，其機制是由于L02細(xì)胞對CdTe QDs攝入水平高于HepG2細(xì)胞，引發(fā)更為嚴(yán)重的線粒體膜損傷，線粒體功能受損和更高的ROS水平，造成氧化應(yīng)激，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。但是有關(guān)2種細(xì)胞之間的毒性差異的機制仍需進(jìn)一步探討，需要進(jìn)一步闡明在分子水平上的差異，為更好地評價CdTe QDs的肝毒性提供理論依據(jù)。

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