分子標記輔助選擇改良雜交水稻組合豐兩優(yōu)香1號的白葉枯病抗性

梁發(fā)茂 王利潤 徐俊英，李志新

( 長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025)( 中國種子集團有限公司生命科學技術(shù)中心，湖北 武漢 430223)長江大學農(nóng)學院，湖北 荊州 434025；主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省

革蘭氏陰性菌黃單胞桿菌水稻變種(Xanthomonasoryoryzaepv.oryzae, Xoo)引起的水稻白葉枯病( Bacterial Blight,BB)是影響世界水稻生產(chǎn)的最嚴重的細菌性病害之一，該病發(fā)生可導致水稻嚴重減產(chǎn)和品質(zhì)下降。1884年日本福岡地區(qū)首發(fā)白葉枯病以來，其發(fā)病范圍不斷擴大。目前，包括亞洲主要產(chǎn)稻國在內(nèi)，澳洲、非洲和美洲等地區(qū)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)白葉枯病。我國除新疆外，全國各地均有發(fā)生，成為我國僅次于稻瘟病的第二大病害。由于該病危害嚴重，且化學方法難以防治，培育抗病品種便成了克服白葉枯病最有效的途徑[1]，水稻白葉枯病自發(fā)現(xiàn)以來，各國科學家投入大量精力研究，目前我國粳稻品種大多帶有Xa3基因，粳稻品種大多攜帶Xa4，這2個抗性基因的應用成功地抑制了我國白葉枯病的大面積爆發(fā)。20世紀80年代，我國廣東省出現(xiàn)了能侵染Xa4的Ⅴ型菌，并向其他周邊省區(qū)擴展[2]。 2005年該病在我國蘇、皖一帶重新爆發(fā)[3]。我國稻區(qū)流行小種的監(jiān)測表明，我國國內(nèi)稻區(qū)病菌小種的組成基本穩(wěn)定，目前流行的優(yōu)勢小種仍為CⅠ和CⅡ，但Ⅴ型菌的頻率有所增加[4]。南方秈稻區(qū)以Ⅳ型為主，長江中下游秈、粳區(qū)以Ⅳ和Ⅱ型為主，北方粳稻區(qū)以Ⅰ和Ⅱ型居多[5]。

截止到2016年，經(jīng)期刊報道和國際注冊的白葉枯抗性基因已有40個[6]，其中5個顯性基因Xa1[7]、Xa21[8]、Xa23[9]、Xa3/Xa26[10，11]和Xa27[12]，2個隱性基因xa5[13]和xa13[14]已被克隆。大量抗性基因的鑒定和克隆為分子標記輔助選擇育種提供了基因資源，而利用分子標記輔助選擇技術(shù)改良水稻恢復系的抗病性效果顯著。Huang等[15]將白葉枯抗性基因Xa7、Xa21、Xa22和Xa23導入恢復系華恢1035中，顯著提高水稻恢復系及其雜交組合白葉枯病抗性；楊豐宇等[16]利用分子標記輔助選擇改良早秈稻1701的稻瘟病抗性。譚令辭等[17]利用Pi9基因分子標記輔助選擇成功培育出抗稻瘟病水稻新品系，加快了作物育種中間材料的選育進程。樓玨等[18]聚合稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱抗性基因選育帶有抗性基因且農(nóng)藝性狀良好的改良恢復系，為雜交稻抗病蟲育種提供了理論依據(jù)。

豐兩優(yōu)香1號是合肥豐樂種業(yè)選育的優(yōu)勢雜交水稻，通過多省和國家審定，在長江中下游地區(qū)種植面積較大，且曾為湖北省中秈組對照品種，但由于該恢復系感白葉枯病，其應用推廣受到一定限制。鑒于此，本研究利用攜Xa7和Xa21的供體親本R119(Xa7)和R161(Xa21)通過分子標記輔助選擇、回交和聚合雜交相結(jié)合，改良三系恢復系豐香恢1號的白葉枯病抗性，構(gòu)建了農(nóng)藝性狀與豐香恢1號相似的改良株系和聚合系，并對穩(wěn)定改良株系及其所配雜交組合進行了抗性、產(chǎn)量和品質(zhì)的評價。

1　材料與方法

1.1　水稻材料

Xa7、Xa21的基因供體親本分別為R119和R161，為本研究組創(chuàng)建；受體材料豐香恢1號由合肥豐樂種業(yè)有限公司提供，感病對照IR24均由上海農(nóng)業(yè)基因中心提供。

1.2　水稻白葉枯病菌系

本研究所用2個來自于菲律賓的菌株P(guān)XO61(P1)和PXO99(P6)由上海農(nóng)業(yè)基因中心提供；3個來自于中國的Zhe173( C4)、FuJ(C8)和GD1358( C5)由湖北省宜昌市農(nóng)業(yè)科學研究院提供，菌系劃分見文獻[19，20]。

1.3　試驗方法

1.3.1單基因?qū)胂岛突蚓酆舷档臉?gòu)建

本研究以豐香恢1號為輪回親本，分別用攜有Xa7、Xa21基因的R119(Xa7)和R161(Xa21)為父本分別進行雜交和回交，構(gòu)建各單基因的導入系。各回交世代利用分子標記輔助選擇，采用人工接種鑒定，選擇農(nóng)藝性狀與豐香恢1號相似的優(yōu)良陽性單株繼續(xù)回交，回交3代后，選擇背景與豐香恢1號相似的株系自交3～4代，通過人工接種鑒定和分子標記選擇目標基因純合的穩(wěn)定株系。

利用攜有Xa7和Xa21的穩(wěn)定株系復交和自交，F(xiàn)4代運用人工接種鑒定和分子標記選擇背景與豐香恢1號相似的抗性優(yōu)良的目標基因純合的穩(wěn)定株系為抗性基因聚合系。共計得到分別含有Xa7、Xa21、Xa7+Xa21的穩(wěn)定株系各1個，命名排序為X01～X03。2016年7月，在長江大學農(nóng)學院試驗田對這3個穩(wěn)定株系及其所配組合進行白葉枯病抗性鑒定和田間農(nóng)藝性狀考察等試驗。

1.3.2白葉枯病抗性鑒定

表1　水稻白葉枯病抗性評價標準

2016年5月10日，3個改良株系及其所配組合、2個對照材料和IR24分別播種于長江大學農(nóng)學院試驗田，6月1日插秧，單本插，密度為16.7cm×20cm，每材料種植8株，設(shè)置7個重復，菌株培養(yǎng)參見Lin等方法[20]。分蘗盛期以5個菌系( PXO61、PXO99、Zhe173、GD1358、和FuJ)進行抗性鑒定，選取主莖劍葉平展葉片，用預先滅菌處理的、型號一致的平口剪刀沾取濃度約為3×108cfu/mL菌懸液，剪去葉尖2～3cm，每株接種3～4片葉，每區(qū)材料剪葉數(shù)大于30片[20]。接種后21d左右，當感病對照IR24病情穩(wěn)定時，調(diào)查植株的抗性水平，抗性評價標準見表1。

1.3.3 改良株系及雜交組合的主要農(nóng)藝性狀及稻米品質(zhì)分析

2016年5月10日，豐香恢1號及其改良株系X01～X03所配雜交組合種植于長江大學農(nóng)學院試驗田，每區(qū)材料分3行種植，每行10株，密度為16.7cm×20cm。9月成熟期，各區(qū)材料隨機取5株進行室內(nèi)農(nóng)藝性狀考察。考查的主要農(nóng)藝性狀包括全生育期、株高、單株有效穗數(shù)、平均穗長、每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等。

根據(jù)國家優(yōu)質(zhì)稻標準( GB/T17891-1999)測定方法，對改良株系、雜交組合及對照組合的稻米進行外觀品質(zhì)和蒸煮品質(zhì)分析，包括糙米率、精米率、整精米率、堊白度、堊白粒率、糊化溫度、膠稠度和直鏈淀粉含量等。

1.4　抗性基因的分子標記選擇

1.4.1DNA提取和標記選擇

提取DNA參見樓巧君等[21]的簡化CTAB法。其中，與Xa7基因緊密連鎖的標記RM20582引物設(shè)計參見Chen等[22]，與Xa21基因緊密連鎖的引物PTA248參見文獻[23]。各標記的詳細信息見表2。

表2　白葉枯抗性基因緊密連鎖的分子標記和序列

1.4.1PCR擴增體系

20μL的擴增反應體系包含20ng模板DNA，2μL的10×buffer、1.8μL的2.5mmol/L MgCl2、1.8μL的2mmol/L dNTP、10μmol/L的正反引物各0.2μL，1.5U的Tag酶0.2μL，加滅菌的雙蒸水至20μL，進行PCR擴增。反應程序為94℃下預變性5min，94℃ 30s、55℃ 30s (其中PTA248的退火溫度為60℃)、72℃ 45s循環(huán)反應34次，72℃下延伸反應10min后于4℃保存，擴增產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖膠或4%聚丙烯酰胺( PAGE)凝膠電泳后用溴化乙腚( EB)或硝酸銀染檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1　改良株系的構(gòu)建及分子標記輔助選擇

2011年夏在荊州用供體親本R119(Xa7)和R161(Xa21)分別與豐香恢1號開始雜交，以后每年在荊州、海南進行2個世代的回交、聚合雜交和自交，至2016年春季，已經(jīng)育成含有抗性基因的農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的改良株系3個，其中攜帶抗性基因Xa7、Xa21、Xa7+Xa21株系各1個。

利用2個與抗性基因緊密連鎖的分子標記RM20582和PTA248，對供體親本，受體親本豐香恢1號及雜合基因型進行多態(tài)性分析，各連鎖標記在親本間均表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，在雜合基因型中有明顯共顯性分離，說明這2個標記可用來鑒別后代群體的分離基因型。每一回交和自交世代中都運用分子標記輔助選擇陽性基因型單株。最終獲得穩(wěn)定純合的株系3個，命名排序為X01～X03。2016年夏季，在荊州對育成株系X01 (Xa7)和X02(Xa21)取10株進行分子檢測，每個株系的PCR擴增帶型與供體親本一致( 圖1～2)，說明改良株系均攜帶抗性基因，且目標基因已經(jīng)穩(wěn)定純合。

M：2kb Marker；P1：受體親本；P2：供體親本；1～10：X02株系的單株圖1　PTA248( Xa21)標記在X02改良株系的PCR擴增

M：2kb Marker；P1：供體親本；P2：受體親本；1～10：X01株系的單株圖2　RM20582( Xa7)標記在X01改良株系的PCR擴增

2.2　親本、改良株系及其雜交組合的白葉枯病的抗性評價

2016年7月，在水稻孕穗期用5個菌種對研究材料進行白葉枯病抗性鑒定，鑒定結(jié)果見表3。分析結(jié)果表明，感病材料IR24對7個菌系的抗性表現(xiàn)為感病或高感，平均病斑長度大于18cm，表明接菌反應趨于穩(wěn)定，各菌株致病力正常。對照材料豐香恢1號對5個菌株均表現(xiàn)感病，病斑長度大于9cm。2個基因供體親本的抗性反應如下：R119(Xa7)對菌株P(guān)XO99抗性反應為中感，對其他4個菌株都表現(xiàn)為高抗白葉枯病，平均病斑長度小于1cm；R161(Xa21)對菌株GD1358和FuJ表現(xiàn)為感病，在其他3個菌系中都表現(xiàn)為抗病反應，平均病斑長度小于5cm，表明不同抗性基因?qū)Σ煌硇》N的抗性反應不一致。攜有Xa7基因改良株系X01(Xa7)對菌株P(guān)XO99表現(xiàn)感病，對其他4個菌株都表現(xiàn)為抗病，平均病斑長度小于3cm。攜有Xa21基因的株系X02(Xa21)菌株FuJ表現(xiàn)感病，病斑長度15.88cm，對其他4個菌株表現(xiàn)中抗或高抗，平均病斑長度0.33～4.92cm。攜有Xa7+Xa21基因的株系X03(Xa7+Xa21)對5個菌株均表現(xiàn)抗病，病斑長度為0.21～3.49cm，抗性水平明顯高于單基因改良株系。對其他4個菌株表現(xiàn)中抗或高抗，平均病斑長度0.33～4.92cm。

表3　親本、改良株系及雜交組合的白葉枯病的抗性評價( 2016,荊州)

注：HR-抗；R-抗；MR-中抗；HS-高感；S-感；MS-中感 。

改良株系與不育系廣占63-4S配制的雜交組合的白葉枯病抗性鑒定表明，對照組合豐兩優(yōu)香1號對5個菌株均表現(xiàn)感病，病斑長度為8.59～22.8cm，雜交組合廣占63-4S/X01(Xa7)對菌株P(guān)XO99表現(xiàn)感病，病斑長度為15.69cm，對其他4個菌株表現(xiàn)抗病，病斑長度為0.96～2.96cm；雜交組合廣占63-4S/X02(Xa21)對菌株P(guān)XO99和FuJ表現(xiàn)感病，對其他2個菌株表現(xiàn)抗病，病斑長度為1.52～4.37cm；雜交組合廣占63-4S/X03(Xa7+Xa21)對菌株P(guān)XO99表現(xiàn)感病，對其他4個菌株表現(xiàn)抗病，病斑長度為0.32～2.40cm，從抗性水平表現(xiàn)看，雙基因聚合的雜交組合抗性明顯提高，說明通過分子標記輔助選擇技術(shù)，可以提高豐香恢1號及其雜交組合的抗性。

2.3　改良株系及其雜交組合主要農(nóng)藝性狀分析

成熟期對3個重復中各改良株系及其雜交組合選中間行5個單株測量株高、單株有效穗數(shù)、單穗長、結(jié)實率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀進行考查，結(jié)果見表4。3個改良株系的生育期、單株有效穗數(shù)、平均穗長、千粒重與豐香恢1號無顯著差異，改良株系X02(Xa21)株高顯著高于豐香恢1號，每穗總粒數(shù)和每穗實粒數(shù)顯著多于豐香恢1號；改良株系X03(Xa7+Xa21)每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)和結(jié)實率顯著高于豐香恢1號。3個改良雜交組合與豐兩優(yōu)香1號在生育期和平均穗長性狀無顯著差異。組合廣占63-4S/X01(Xa7)平均穗長、每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重均低于豐兩優(yōu)香1號；組合廣占63-4S/X02(Xa21)與豐兩優(yōu)香1號相比，各性狀均無顯著差異；組合廣占63-4S/X03(Xa7+Xa21)株高顯著低于豐兩優(yōu)香1號，每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)和結(jié)實率均高于豐兩優(yōu)香1號。分析結(jié)果表明，各改良株系經(jīng)過多代回交后基本恢復了豐香恢1號的優(yōu)良背景，在保持其優(yōu)良性狀不變的基礎(chǔ)上大大提高了對白葉枯病的抗性，可以作為良好的育種材料加以利用。

表4　親本、改良株系及其所配組合主要農(nóng)藝性狀比較( 2016，荊州)

注：*、**分別表示0.05和0.01顯著水平。

2.4　改良株系及雜交組合的米質(zhì)分析

3個改良株系及雜交組合的稻米品質(zhì)分析結(jié)果( 表5)表明，3個改良株系的糙米率、精米率、整精米率、長寬比和直鏈淀粉含量與豐香恢1號基本一致，改良株系X01(Xa7)在堊白粒率和堊白度高于豐香恢1號，膠稠度降低，改良株系X02(Xa21)和X03(Xa7+Xa21)在堊白粒率和堊白度低于豐香恢1號。3個雜交組合的品質(zhì)性狀與改良株系基本一致，組合廣占63-4S/X01(Xa7)的堊白粒率和堊白度高于豐兩優(yōu)香1號，組合廣占63-4S/X03(Xa7+Xa21)的堊白粒率和堊白度低于豐兩優(yōu)香1號，直鏈淀粉含量稍高，膠稠度顯著低于豐兩優(yōu)香1號。

表5　親本、改良株系及雜交組合的稻米品質(zhì)分析( 2016，荊州)

3　討論

3.1　抗性基因的合理選擇和利用

雜交稻恢復系白葉枯病改良利用中必須明確目標抗性基因的完全顯性遺傳，能在不同的遺傳背景下完全表達。本研究結(jié)果顯示，同一抗性基因在不同的遺傳背景下表達是有差異的，豐香恢1號背景下的材料對白葉枯病的抗性水平優(yōu)于IR24背景，研究發(fā)現(xiàn)同一基因在不同背景下對同一菌系的反應也有差異，R119(Xa7)與株系X01(Xa7)對菲律賓小種PXO99都表現(xiàn)感病，但改良株系的病斑長度明顯大于R119(Xa7)，供體親本R162(Xa21)對菌株GD1359和FuJ表現(xiàn)感病，而改良株系X02(Xa21)僅對菌株FuJ表現(xiàn)感病，抗性水平相對高于供體親本。這也說明在抗性基因的選擇和利用方面，應有目的地了解當?shù)氐膬?yōu)勢小種。針對我國長江中下游地區(qū)Ⅳ和Ⅱ菌為優(yōu)勢小種，華南稻區(qū)Ⅴ型菌為優(yōu)勢小種，本研究在結(jié)合以往研究基礎(chǔ)上選用Xa21和Xa7 2個抗性基因[24]。結(jié)果顯示Xa7和Xa21均有各自的致病小種，在水稻抗性基因輪換使用及聚合育種等方面有重要意義，同時也表明本研究的2個抗性基因的選擇是科學合理的。

3.2　改良組合的應用評價

分子標記輔助選擇改良過程中，常用的是對目標基因進行前景選擇和目標單株背景選擇相結(jié)合。本研究沒有進行特定背景選擇，目的是在進行選擇與輪回親本性狀一致的基礎(chǔ)上，也希望能選擇一些新類型材料。但在每個世代回交、自交過程中選擇陽性單株，均選擇與輪回親本性狀一致的單株回交、自交，且在每一世代都采用人工接種與基因型相結(jié)合的選擇方式，以提高選擇準備率。本研究目的是在保持豐香恢1號優(yōu)良性狀不變的基礎(chǔ)上提高其對白葉枯病的抗性。研究過程中，得到含有不同抗性基因的改良株系20個，最終選擇出3個改良株系進行分析。從研究結(jié)果可以看出，這3個改良株系及其所配雜交組合的抗性明顯提高，產(chǎn)量及品質(zhì)方面與對照基本一致或優(yōu)于對照，特別是組合廣占63-4S/X03(Xa7+Xa21)可以作為豐兩優(yōu)香1號的替換組合用于水稻生產(chǎn)。

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