I 型膠原水凝膠的物質(zhì)通透性評(píng)價(jià)

【作　者】段曉杰，劉珊，馬躍，孫雪蓮，王金恒，邵安良，徐麗明

1 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京市，102629

2 關(guān)節(jié)動(dòng)力安達(dá)（天津）生物科技有限公司，天津市，300308

3 北京三藥科技開發(fā)公司，北京市，100176

0　引言

水凝膠（Hydrogel）是以水為分散介質(zhì)的凝膠，在具有網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)的水溶性高分子中引入一部分疏水基團(tuán)和親水殘基，親水殘基與水分子結(jié)合，將水分子連接在網(wǎng)狀內(nèi)部，而疏水殘基遇水膨脹，形成交聯(lián)聚合物。因此，水凝膠性質(zhì)柔軟，能保持一定的形狀，能吸收大量的水。天然的親水性高分子包括多糖類（淀粉、纖維素、海藻酸、透明質(zhì)酸，殼聚糖等）和多肽類（膠原、聚L-賴氨酸、聚L-谷胺酸等）。合成的親水高分子包括醇、丙烯酸及其衍生物類（聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚N-聚代丙烯酰胺等）[1]。鑒于水凝膠的這一特性，近年來(lái)被逐漸應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)療領(lǐng)域[2]。近年來(lái)蠶絲蛋白及絲蛋白絲膠的研究較多，單獨(dú)或者復(fù)合其他物質(zhì)（例如藻酸鹽、殼聚糖及膠原）制備成水凝膠，用于細(xì)胞、藥物緩釋的載體或者用于組織工程支架材料等再生醫(yī)療[3-6]。

有研究顯示一種新型水凝膠生物材料，在軟骨修復(fù)手術(shù)中將其注入骨骼小洞，能幫助刺激病人骨髓產(chǎn)生干細(xì)胞，長(zhǎng)出新的軟骨[7]。有研究用陶瓷和水凝膠研發(fā)出一種混合支架材料，用于軟骨和骨的同時(shí)再生[8]。也有研究制備殼聚糖溫敏性水凝膠用于組織工程支架材料[9]；或者從豬的半月板制備細(xì)胞外基質(zhì)衍化的水凝膠用于人的半月板修復(fù)和再生[10]。

水凝膠的一個(gè)很重要的性能，應(yīng)具有良好的可滲透性，以促進(jìn)及保持細(xì)胞活力、運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)及廢物、釋放藥物等。其中物質(zhì)傳遞性能是指細(xì)胞、營(yíng)養(yǎng)、廢物以及生物活性物質(zhì)進(jìn)入水凝膠或在水凝膠中擴(kuò)散的能力。《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品水凝膠表征指南》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1]中要求，對(duì)水凝膠物質(zhì)傳遞性能的評(píng)估宜在某一尺度范圍（如小分子、蛋白質(zhì)與細(xì)胞）進(jìn)行；宜同時(shí)考慮水凝膠的主動(dòng)運(yùn)輸（例如液體流動(dòng)）與被動(dòng)運(yùn)輸（例如擴(kuò)散）行為；檢測(cè)宜在能代表產(chǎn)品最終使用情況（例如樣品的幾何形狀、研究時(shí)限、生物成分）的條件下進(jìn)行。然而，目前還沒(méi)有具體的方法用于評(píng)價(jià)水凝膠的營(yíng)養(yǎng)、廢物等物質(zhì)傳遞性能。

本研究建立了用于評(píng)價(jià)水凝膠的營(yíng)養(yǎng)、廢物等物質(zhì)傳遞性能的方法，能夠科學(xué)合理地評(píng)價(jià)水凝膠的物質(zhì)傳遞性能，為該類產(chǎn)品的生物性能評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。同時(shí)，用所建立的方法科學(xué)地評(píng)價(jià)了用于軟骨再生的膠原水凝膠產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)、廢物等物質(zhì)傳遞性能。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1儀器設(shè)備

所用儀器設(shè)備包括：恒溫?fù)u床（HZQ-X100，豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；酶標(biāo)儀（M5，Molecular Devices）；低溫高速離心機(jī)（3k15，Sigma）；96孔板震蕩器(MX-M，dragon lab)；高精度天平（0.000 1 g，F(xiàn)A1104N，菁華電子公司）。

1.1.2主要試劑耗材

涉及主要試劑耗材為：PBS（AB10115027，HyClone）；BSA-FITC（20161214，北京索萊寶科技有限公司）；Transwell雙室裝置（3402，costar）；黑色酶標(biāo)板（3603，costar）；外用凍干人纖維蛋白粘合劑（簡(jiǎn)稱纖維蛋白膠”，201411SO99，上海萊士血液制品股份有限公司）。

1.1.3試驗(yàn)材料

本研究的樣品名為I型膠原蛋白植入基質(zhì)（CaReS-1S），為乳白色圓柱形凝膠態(tài)固體，無(wú)肉眼可見的雜物和變色，雙層無(wú)菌包裝，由關(guān)節(jié)動(dòng)力安達(dá)（天津）生物科技有限公司提供。

I型膠原蛋白植入基質(zhì)是由組分A（I型膠原蛋白溶液）和組分B（凝膠中性溶液）成比例混合而成。I型膠原蛋白溶液是來(lái)自無(wú)特定病原CD大鼠鼠尾肌腱的I型膠原蛋白，用酸溶解得到的膠原蛋白溶液。酸性I型膠原蛋白溶液被凝膠中性溶液中和，可以誘導(dǎo)自然纖維重組形成的凝膠態(tài)I型膠原蛋白植入基質(zhì)，泡罩包裝，最后以鈷60輻照滅菌。

1.2　方法

1.2.1試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)參考《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 水凝膠表征指南》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YY/T 1435ü2016）。為考察膠原水凝膠產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及廢物的傳遞能力，本研究選擇了雙室裝置（細(xì)胞培養(yǎng)用Transwell）作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

根據(jù)本研究樣品的預(yù)期臨床使用目的，擬選擇模擬關(guān)節(jié)滑液的微環(huán)境研究水凝膠樣品的物質(zhì)傳遞性能。關(guān)節(jié)滑液是血漿漏出液，由滑膜表層的B細(xì)胞所產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶蛋白復(fù)合體和血漿的漏出液混合而成[11]，而血漿中含量最多的蛋白是血清白蛋白，占血漿總蛋白的40%～60%[12]。正常的關(guān)節(jié)滑液呈粘稠狀，其中還含有一些分子量較大的脂類、糖類分子和黏蛋白[13-14]。關(guān)節(jié)滑液的功能為提供營(yíng)養(yǎng)、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)面、增加關(guān)節(jié)活動(dòng)。另一方面，細(xì)胞代謝等途徑可能產(chǎn)生膠原蛋白、糖胺多糖、小分子物質(zhì)（氨類、二氧化碳）等[15]。鑒于此，本研究將選擇熒光素標(biāo)示的牛血清白蛋白（BSA-FITC），組合在磷酸鹽緩沖液（PBS）中作為營(yíng)養(yǎng)與廢物的指示物，通過(guò)檢測(cè)該物質(zhì)透過(guò)水凝膠的濃度，用以評(píng)價(jià)水凝膠的物質(zhì)傳遞能力。

實(shí)驗(yàn)條件①擴(kuò)散介質(zhì)：基礎(chǔ)擴(kuò)散介質(zhì)為PBS，pH值為7.2。加入易檢測(cè)濃度的BSA-FITC熒光指示物作為擴(kuò)散液。②實(shí)驗(yàn)溫度：35～37 ℃。③靜止放置。1.2.2 熒光檢測(cè)方法學(xué)考察

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定BSA-FITC合適的檢量線最高濃度（熒光度值在易讀范圍），作為工作液濃度，建立BSA-FITC熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。如：將BSA-FITC配置成工作液濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781 μg·mL-1，考察標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性、回收率、重復(fù)性，靈敏度和最低檢測(cè)限。

1.2.3實(shí)驗(yàn)過(guò)程

利用培養(yǎng)小室作為擴(kuò)散室，把膠原水凝膠放置在小室內(nèi)，在水凝膠與小室之間用纖維蛋白膠密封，防止擴(kuò)散介質(zhì)從邊縫滲入下層。在小室內(nèi)加入含有BSA-FITC熒光標(biāo)記物的擴(kuò)散介質(zhì)（100 μL的PBS, 含100 μg/mL的BSA-FITC），在小室的下層接受室內(nèi)加入足夠的不含BSA-FITC的基礎(chǔ)擴(kuò)散介質(zhì)（PBS）。在靜態(tài)條件下，及35～37 ℃放置1 h、3 h、5 h、24 h、28 h后（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，5 h之內(nèi)滲透較快，5 h之后滲透變得緩慢，24 h已達(dá)到100%的滲透率）收集接受室內(nèi)的擴(kuò)散介質(zhì)，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將試驗(yàn)樣品的檢測(cè)熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算BSA-FITC透過(guò)量。每組設(shè)定3個(gè)平行樣。

1.2.4結(jié)果計(jì)算

水凝膠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò)率（Transparent Rate）表示為：BSA-FITC的透過(guò)百分比（TR, %),

TR = (下層擴(kuò)散介質(zhì)BSA-FITC濃度h體積/BSA-FITC加入濃度h體積) h100%

計(jì)算下層擴(kuò)散介質(zhì)中熒光物質(zhì)濃度，以及所占加入總量的比例，從而評(píng)價(jià)樣品營(yíng)養(yǎng)與廢物的傳遞能力。

2　結(jié)果與分析

2.1　方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1線性關(guān)系考察

BSA-FITC檢量線的線性及其定量下限考察結(jié)果見表1。三次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果顯示，在100 μg·mL-1～0.781 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，其R2均大于0.99，其定量下限 (Lower Limit of Quantity, LLOQ)為3.125 μg·mL-1。

表1　BSA-FITC檢量線的線性和定量下限Tab.1 The linearity and LLQQ of BSA-FITC

2.1.2精密度考察

分別配制50、12.5、3.125 μg·mL-1，三個(gè)質(zhì)量濃度（理論值）的標(biāo)準(zhǔn)品工作液各3份，每份做3個(gè)復(fù)孔，分別進(jìn)行測(cè)定。按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得實(shí)測(cè)濃度（實(shí)測(cè)值），計(jì)算組間精密度。結(jié)果如表2所示，高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度平行樣本間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation, RSD）分別為4.57%、2.47%、2.24%。

表2　精密度考察結(jié)果Tab.2 Results of accuracy evaluation

2.1.3檢測(cè)回收率考察

平行制備濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg·mL-1BSA-FITC標(biāo)準(zhǔn)品溶液3份，每份3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算回收率，如表3所示，回收率均在80%～120%范圍內(nèi)。

2.2　水凝膠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)透過(guò)率

2.2.1擴(kuò)散介質(zhì)回收及BSA-FITC檢測(cè)

表3　檢測(cè)回收率考察結(jié)果Tab. 3 Results of detection recovery rate evaluation

在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)回收下層接受室的擴(kuò)散介質(zhì)，并用移液槍標(biāo)定回收擴(kuò)散介質(zhì)的體積。同時(shí)取置于對(duì)照孔中BSA-FITC（50 μg·mL-1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線初始濃度樣品，依次倍比稀釋6個(gè)濃度，以PBS作為背景對(duì)照，分別加入到黑色酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為493 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為550 nm，進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.2水凝膠樣品的BSA-FITC透過(guò)率

本次試驗(yàn)的檢量線（24 h樣品檢測(cè)）見圖1。其他時(shí)間點(diǎn)的檢量線圖略。

圖1　24 h樣品的檢量線圖Fig.1 Standard curve for 24 h sample detection

各時(shí)間點(diǎn)樣品的檢量線方程如下：

1 h樣品的檢量線方程：y = 9.884x + 2.260, R2= 0.999

3 h樣品的檢量線方程：y = 8.210x-4.531, R2= 0.996

5 h樣品的檢量線方程：y= 7.192x + 0.469, R2= 0.999

24 h樣品的檢量線方程：y = 9.636x + 2.360, R2= 0.998

28 h樣品的檢量線方程：y = 10.270x-0.606, R2= 0.999

本次實(shí)驗(yàn)所用的水凝膠樣品為I型膠原蛋白植入基質(zhì)”，其BSA-FITC透過(guò)率檢測(cè)和計(jì)算結(jié)果見表4。

在實(shí)驗(yàn)中，考慮到熒光的自然衰減，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組BSA-FITC（與試驗(yàn)組加入的BSA-FITC量相同，置于Transwell孔中），作為標(biāo)準(zhǔn)曲線初始濃度的樣品。由表4 的結(jié)果可以看到，在最初的5 h前水凝膠樣品的BSA-FITC透過(guò)較快，呈現(xiàn)時(shí)間依存性，5 h時(shí)滲透率達(dá)到了約50%。5 h之后的滲透速率減緩。預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示24 h的時(shí)候水凝膠樣品BSA-FITC已經(jīng)達(dá)到了100%的滲透，然而，本次正式實(shí)驗(yàn)在24 h滲透率并未達(dá)到100%，因此，延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間至28 h，觀察到了水凝膠樣品BSA-FITC達(dá)到了100%的滲透。其中，在所有試驗(yàn)樣品組及所有時(shí)間點(diǎn)，Transwell中水凝膠樣品的上層最初加入的BSA-FITC/PBS均已全部滲透進(jìn)水凝膠樣品中，或者透過(guò)了水凝膠樣品，說(shuō)明I型膠原蛋白植入基質(zhì)水凝膠樣品具有很好的吸水性和物質(zhì)傳遞性。

表4　水凝膠樣品的BSA-FITC透過(guò)率Tab. 4 BSA-FITC transparent rate of hydrogel sample

3　小結(jié)與討論

I型膠原蛋白植入基質(zhì)是一種水凝膠物質(zhì)，預(yù)期用于植入到關(guān)節(jié)軟骨缺損部位，治療局灶性膝關(guān)節(jié)軟骨缺損。為評(píng)價(jià)I型膠原蛋白水凝膠物質(zhì)的物質(zhì)通透性，本研究建立了以BSA-FITC為指示物，組合PBS作為通透介質(zhì)的體外物質(zhì)通透性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法。該方法在100 μg·mL-1～0.781 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，其R2大于0.99，其定量下限（LLOQ）為3.125 μg·mL-1；RSD＜5%；回收率在80%～120%范圍內(nèi)。利用該方法，結(jié)合Transwell的使用，檢測(cè)I型膠原蛋白植入基質(zhì)水凝膠樣品，結(jié)果顯示在37 ℃靜置狀態(tài)下28 h后樣品的BSA-FITC通透率為100%，顯示了較好的物質(zhì)通透性。

[1] 中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理總局. YY/T 1435ü2016 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 水凝膠表征指南[S].

[2]Hacker M C, Nawaz H A. Multi-functional macromers for hydrogel design in biomedical engineering and regenerative medicine[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(11): 27677-27706.

[3]Wang Z, Zhang Y, Zhang J, et al. Exploring natural silk protein sericin for regenerative medicine: an injectable, photoluminescent,cell-adhesive 3D hydrogel[J]. Sci Rep, 2014, 4: 7064.

[4]Zhang Y, Liu J, Huang L, et al. Design and performance of a sericin-alginate interpenetrating network hydrogel for cell and drug delivery[J]. Sci Rep, 2015, 5: 12374.

[5]Wang Z, Wang J, Jin Y, et al. A neuroprotective sericin hydrogel as an effective neuronal cell carrier for the repair of ischemic stroke[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2015, 7(44): 24629-24640.

[6] Khampieng T, Aramwit P, Supaphol P, et al. Silk sericin loaded alginate nanoparticles: Preparation and anti-inflammatory eきcacy[J]. Int J Biol Macromol, 2015, 636-643.

[7] 新型水凝膠生物材料可修復(fù)膝蓋軟骨[N]. 科技日?qǐng)?bào)，2013-01-16.

[8]Seol Y J, Park J Y, Jeong W, et al. Development of hybrid scaあolds using ceramic and hydrogel for articular cartilage tissue regeneration[J]. J Biomed Mater Res A, 2015, 103(4):1404-1413.

[9] Zang S, Dong G, Peng B, et al. A comparison of physicochemical properties of sterilized chitosan hydrogel and its applicability in a canine model of periodontal regeneration[J]. Carbohydr Polym,2014, 113: 240-248.

[10] Wu J, Ding Q, Dutta A, et al. An injectable extracellular matrix derived hydrogel for meniscus repair and regeneration[J]. Acta Biomater, 2015, 16: 49-59.

[11] 黃淦堂. 關(guān)節(jié)液的檢驗(yàn)及臨床意義[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)外科學(xué)分冊(cè),1989, 2: 68-71.

[12] Quinlan G J, Martin G S, Evans T W. Albumin: biochemical properties and therapeutic potential[J]. Hepatology, 2005, 41(6):1211-1219.

[13] Michela S, Sabrina B. Optimization of Cellular analysis of Synovial Fluids by optical microscopy and automated count using the Sysmex XN Body Fluid Mode[J]. Clin Chim Acta, 2016, 462:41-48.

[14] Hermansen P, Freemont T. Synovial fl uid analysis in the diagnosis of joint disease[J]. Diagnostic Histopathol, 2017, 4: 1-10.

[15] 沈強(qiáng), 臧鴻聲, 賈連順, 等. 軟骨細(xì)胞植入膠原蛋白重建類軟骨組織的體外培養(yǎng)研究[J]. 中華外科雜志, 1994, 32(4): 252-254.