甘薯羽狀斑駁病毒RT-LAMP快速檢測(cè)方法的建立

姜珊珊，馮佳，張眉，王升吉，辛志梅，吳斌，辛相啟

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甘薯羽狀斑駁病毒RT-LAMP快速檢測(cè)方法的建立

姜珊珊，馮佳，張眉，王升吉，辛志梅，吳斌，辛相啟

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100）

【】甘薯羽狀斑駁病毒（，SPFMV）侵染甘薯造成重要危害，本研究旨在利用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）建立一種快速、高效檢測(cè)SPFMV的方法?！尽繌腉enBank上獲得SPFMV外殼蛋白（coat protein，CP）基因的核苷酸序列，利用Primer Explorer V4設(shè)計(jì)4條RT-LAMP特異性引物SPFMV-FIP（5′-TAAGCGCGGCTGCC TTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′）、SPFMV-BIP（5′-TCGGTTGTTTGGTTTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′）、SPFMV-F3（5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′）和SPFMV-B3（5′-ACCCCTCATTCCTAAGAGGT-3′），同時(shí)設(shè)計(jì)2條反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）的特異性引物SPFMV-F（5′-TCTAATGAGAACACTGAA TT-3′）和SPFMV-R（5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′）。分別設(shè)置F3/B3﹕FIP/BIP引物濃度比（1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10），dNTPs濃度梯度（0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825 mmol·L-1），Betaine濃度梯度（0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1），反應(yīng)溫度（59、61、63、65、67和69℃）和反應(yīng)時(shí)間（20、30、40、50、60、70、80和90 min），對(duì)RT-LAMP反應(yīng)體系各條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系。通過(guò)測(cè)序及酶切對(duì)RT-LAMP產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。以攜帶SPFMV、甘薯C病毒（C，SPVC）、甘薯褪綠矮化病毒（，SPCSV）、甘薯病毒2（2，SPV2）、甘薯潛隱病毒（，SPLV）、甘薯G病毒（G，SPVG）、甘薯褪綠斑病毒（，SPCFV）和健康甘薯葉片的總RNA為模板，分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR特異性檢測(cè)；帶有SPFMV的甘薯總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)訰NA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀釋液為模板進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR靈敏度測(cè)定。最后利用優(yōu)化的RT-LAMP體系對(duì)山東省多地采集的SPFMV疑似病樣進(jìn)行檢測(cè)，加入SYBR green I進(jìn)行可視化檢測(cè)。【】建立了SPFMV的RT-LAMP快速特異性檢測(cè)方法，優(yōu)化的反應(yīng)體系：引物SPFMV-FIP/SPFMV-BIP為0.8 μmol·L-1，SPFMV-F3/SPFMV-B3為0.2 μmol·L-1，dNTPs為0.325 mmol·L-1，Betaine為1 mol·L-1；65℃反應(yīng)70 min。特異性試驗(yàn)顯示本研究建立的RT-LAMP只對(duì)攜帶SPFMV的RNA能夠擴(kuò)增出典型的梯狀條帶。RT-LAMP最低可檢測(cè)的RNA濃度為121.6×10-4ng·μL-1，而RT-PCR最低能檢測(cè)的RNA濃度為121.6×10-3ng·μL-1，表明RT-LAMP的靈敏度比RT-PCR高10倍。田間樣品檢測(cè)，RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果與可視化檢測(cè)結(jié)果一致，表明本研究建立的RT-LAMP快速檢測(cè)方法可有效應(yīng)用到SPFMV的田間檢測(cè)?！尽拷⒌腞T-LAMP快速檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好，適用于SPFMV的田間快速檢測(cè)。

甘薯；甘薯羽狀斑駁病毒；反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；檢測(cè)

0 引言

【研究意義】甘薯（）是繼小麥、水稻、玉米、馬鈴薯、大麥和木薯之后的世界第七大糧食作物，同時(shí)也是重要的飼料和輕工業(yè)原料[1-3]。病毒病是威脅甘薯生產(chǎn)的重要病害，全世界因病毒病造成的甘薯?yè)p失每年高達(dá)30%—50%，在中國(guó)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)40億元[4-5]。甘薯羽狀斑駁病毒（，SPFMV）是甘薯上的重要病毒，屬于馬鈴薯Y病毒屬（）成員，通過(guò)汁液或蚜蟲(chóng)以非持久性方式傳播，在世界主要甘薯產(chǎn)區(qū)幾乎均有發(fā)現(xiàn)[6-8]。SPFMV可侵染甘薯等8種旋花科植物，在植株不同的生長(zhǎng)時(shí)期表現(xiàn)的癥狀也不相同，嚴(yán)重危害甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[9]。近年來(lái)，SPFMV在中國(guó)多?。ㄊ校┚邪l(fā)生，且分布地區(qū)呈逐年擴(kuò)展的趨勢(shì)[2-3,9]。因此建立一種簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法對(duì)SPFMV的早期預(yù)警以及了解發(fā)病規(guī)律具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】2010年，張業(yè)輝等[10]建立了包括SPFMV在內(nèi)的3種甘薯病毒的多重PCR檢測(cè)方法，隨后針對(duì)SPFMV的ELISA[11]、RT-PCR[2,11]、熒光定量RT-PCR[12-13]、反向斑點(diǎn)雜交[14]等檢測(cè)方法被逐步建立。筆者實(shí)驗(yàn)室前期已通過(guò)生物學(xué)鑒定、電鏡觀察及RT-PCR等多種技術(shù)對(duì)山東地區(qū)的SPFMV等多種甘薯病毒進(jìn)行了檢測(cè)[2]。以上幾種檢測(cè)方法均為了解SPFMV的田間發(fā)病情況提供了技術(shù)保證。反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是2000年由Notomi 開(kāi)發(fā)的一種新型核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)針對(duì)目的序列設(shè)計(jì)4條引物，特異性識(shí)別6個(gè)序列區(qū)，利用DNA鏈置換聚合酶（BstDNA polymerase）在60—65℃恒溫條件下進(jìn)行高效擴(kuò)增[15]。RT-LAMP已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)[16-17]、動(dòng)物[18-19]、植物[20-30]病原菌的檢測(cè)中，在糧食[20-22,27]、蔬菜[23-26]、果樹(shù)[28]以及經(jīng)濟(jì)作物[29-30]的病毒病害檢測(cè)工作中發(fā)揮了重要作用。喬奇等[27]建立了針對(duì)甘薯褪綠矮化病毒（，SPCSV）的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)。迄今國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)利用該技術(shù)檢測(cè)SPFMV的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】現(xiàn)有RT-PCR和熒光定量PCR等分子檢測(cè)技術(shù)雖然已有高特異性和靈敏度的特點(diǎn)，但需要特定的儀器和專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)人員來(lái)完成，不適用基層檢測(cè)。血清學(xué)檢測(cè)需要特異性抗血清，制作過(guò)程繁雜、成本昂貴，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。生物學(xué)鑒定和電鏡觀察費(fèi)時(shí)費(fèi)工，需要檢測(cè)樣品中病毒含量高。RT-LAMP作為一種新型的檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、特異等特點(diǎn)，不需要對(duì)模板進(jìn)行熱變性，可在等溫條件下進(jìn)行，短時(shí)間內(nèi)即可獲得試驗(yàn)結(jié)果[15]。基于此，本研究建立針對(duì)SPFMV的RT-LAMP快速檢測(cè)技術(shù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)SPFMV RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)的各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證RT-LAMP擴(kuò)增的特異性和靈敏度，建立一種SPFMV的新型、快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，為甘薯病毒病害的監(jiān)測(cè)防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年5月至2017年9月在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

1.1.1 植物材料 從山東臨沂地區(qū)甘薯苗床采集具有典型病毒病癥狀的甘薯樣品，種植于防蟲(chóng)溫室中；經(jīng)RT-PCR檢測(cè)確定甘薯病毒種類(lèi)后，置于-80℃保存?zhèn)溆?。選取經(jīng)RT-PCR檢測(cè)不含病毒的甘薯脫毒苗作為陰性對(duì)照。

1.1.2 主要試劑 TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒、dNTPs購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；HiScript?II 1st Stand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自諾唯贊生物公司；DL 2000 DNA Marker、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase酶抑制劑購(gòu)自TaKaRa公司；2×Es Taq MasterMix（Dye）購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；Bst DNA大片段聚合酶、10×Thermopol Reaction Buffer、TⅠ和Ⅰ購(gòu)自NEB，特異性引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；SYBR Green I核酸染料購(gòu)自Solarbio公司；其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中SPFMV的CP基因序列（登錄號(hào)：FJ155666），利用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)RT-LAMP擴(kuò)增引物SPFMV-F3、SPFMV-B3、SPFMV-FIP、SPFMV-BIP共4條；同時(shí)利用DNAMAN設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物SPFMV-F和SPFMV-R共2條，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-LAMP和RT-PCR特異性檢測(cè)SPFMV的引物

1.2.2 總RNA提取及cDNA合成 稱(chēng)取甘薯樣品葉片約0.1 g，液氮冷凍后迅速研磨，按TransZol Plant多糖植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取葉片總RNA，保存于-80℃?zhèn)溆?。按照HiScript?II 1st Stand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)，以RNA為模板合成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) RT-PCR擴(kuò)增體系：2×Es Taq MasterMix 7.5 μL，SPFMV-F/R（10 μmol·L-1）引物各0.2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足總體積至15 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃1 min，循環(huán)35次，終延伸72℃10 min。陰性樣品葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為陰性對(duì)照的模板，ddH2O為空白對(duì)照模板。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 RT-LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化和檢測(cè)體系的建立 RT-LAMP反應(yīng)體系：SPFMV-FIP和SPFMV-BIP引物各1.2 μmol·L-1，SPFMV-F3和SPFMV-B3引物各0.2 μmol·L-1，dNTPs 0.125 mmol·L-1，Betaine 1 mol·L-1，1×Thermo Polreaction buffer，RNA酶抑制劑40 U，Bst DNA polymerase 8 U，M-MLV 200 U；RNA模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL（RNA模板為經(jīng)RT-PCR檢測(cè)及測(cè)序鑒定的感染SPFMV甘薯葉片總RNA）。RT-LAMP 反應(yīng)條件：65℃ 1 h，85℃5 min。健康甘薯葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為陰性對(duì)照的模板，ddH2O為空白對(duì)照模板。設(shè)置SPFMV F3/B3﹕FIP/BIP引物濃度比梯度（1﹕1、1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8和1﹕10），dNTPs濃度梯度（0.025、0.125、0.225、0.325、0.425、0.525、0.625、0.725和0.825 mmol·L-1），Betaine濃度梯度（0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 mol·L-1），不同的反應(yīng)溫度（59、61、63、65、67和69℃）和反應(yīng)時(shí)間（20、30、40、50、60、70、80和90 min）。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.5 RT-LAMP產(chǎn)物鑒定 將RT-LAMP產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離后，切取大小200 bp左右的條帶，回收純化后連接于pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5，PCR鑒定后送陽(yáng)性克隆到進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank已報(bào)道序列進(jìn)行比對(duì)。

用DNAMAN軟件分析RT-LAMP擴(kuò)增片段序列，選用Ⅰ（GAATGCN?）和TⅠ（C?TTAAG）進(jìn)行酶切鑒定，Ⅰ理論酶切片段大小為97和102 bp，TⅠ理論酶切片段大小為75和124 bp。利用苯酚和異丙醇回收純化RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，取1μg擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行TⅠ和Ⅰ單酶切，反應(yīng)體系參照酶試劑盒說(shuō)明書(shū)。取20 μL酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.6 RT-LAMP特異性、靈敏度測(cè)定及熒光染料檢測(cè)RT-LAMP產(chǎn)物 以分別攜帶SPFMV、甘薯C病毒（C，SPVC）、SPCSV、甘薯病毒2（2，SPV2）、甘薯潛隱病毒（，SPLV）、甘薯G病毒（G，SPVG）和甘薯褪綠斑病毒（，SPCFV）的甘薯葉片總RNA為模板，利用優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，并與RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

將感染SPFMV的甘薯葉片總RNA用無(wú)RNA酶的水分別進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的倍比稀釋?zhuān)韵♂尯蟮腞NA作為模板進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR靈敏度對(duì)比試驗(yàn)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.7 RT-LAMP方法的應(yīng)用 提取從山東省采集的疑似SPFMV甘薯植株葉片總RNA，分別用優(yōu)化后的RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。向RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.1 μL SYBR green I 核酸染料，直接觀察檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性為綠色，陰性為橙色[27-28]。

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

為了建立最優(yōu)的RT-LAMP檢測(cè)體系，對(duì)引物濃度、dNTPs濃度、Betaine濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。引物優(yōu)化結(jié)果顯示，SPFMVF3/B3與FIP/BIP的濃度比例在1﹕4、1﹕6、1﹕8時(shí)能檢測(cè)到條帶，1﹕4時(shí)條帶最亮，即F3/B3和FIP/BIP的引物濃度分別為0.2和0.8 μmol·L-1（圖1-A）。對(duì)dNTPs濃度進(jìn)行調(diào)整，結(jié)果顯示dNTPs濃度為0.125—0.525mmol·L-1時(shí)可檢測(cè)到條帶，其中以0.325和0.425 mmol·L-1效果最佳，本著節(jié)儉成本的原則確定dNTPs濃度為0.325mmol·L-1（圖1-B）。進(jìn)一步設(shè)置不同的Betaine濃度，結(jié)果表明在0.4、0.7、1.0和1.3 mol·L-1時(shí)均能檢測(cè)到條帶，濃度為1.0 mol·L-1時(shí)，擴(kuò)增效果最佳（圖1-C）。設(shè)置不同的反應(yīng)溫度，在59—67℃均有條帶，65℃時(shí)條帶最為清晰（圖1-D）。最后對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)持續(xù)40 min時(shí)可觀察到擴(kuò)增條帶，70 min時(shí)擴(kuò)增條帶最亮（圖1-E）。綜上，最終確定SPFMV最優(yōu)的RT-LAMP檢測(cè)體系為SPFMV-FIP和SPFMV-BIP引物各0.8 μmol·L-1，SPFMV-F3和SPFMV-B3引物各0.2 μmol·L-1，dNTPs 0.325 mmol·L-1，Betaine 1 mol·L-1。RT-LAMP反應(yīng)條件為65℃70 min，85℃5 min。

2.2 RT-LAMP產(chǎn)物鑒定

將200 bp左右的RT-LAMP擴(kuò)增條帶進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank已報(bào)道序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，序列與SPFMV（登錄號(hào)AF015540.1）的核苷酸序列同源性為99%，說(shuō)明本體系擴(kuò)增序列為SPFMV的基因序列。RT-LAMP產(chǎn)物酶切結(jié)果顯示，Ⅰ酶切產(chǎn)生條帶為97和102 bp，TⅠ酶切產(chǎn)生的條帶為75和124 bp（圖2），與理論值相符，進(jìn)一步證明該體系擴(kuò)增產(chǎn)物為SPFMV CP基因序列。

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對(duì)照和空白對(duì)照Negative control and blank control。A：F3/B3和FIP/BIP引物濃度比The ratio of primer concentration， 3-8: 1﹕1 (0.2 μmol·L-1﹕0.2 μmol·L-1), 1﹕2 (0.2 μmol·L-1﹕0.4 μmol·L-1), 1﹕4 (0.2 μmol·L-1﹕0.8 μmol·L-1), 1﹕6 (0.2 μmol·L-1﹕1.2 μmol·L-1), 1﹕8 (0.2 μmol·L-1﹕1.6 μmol·L-1), 1﹕10 (0.2 μmol·L-1﹕2.0 μmol·L-1)；B：dNTPs濃度梯度The gradient of dNTPs concentration，3-11: 0.025, 0.125, 0.225, 0.325, 0.425, 0.525, 0.625, 0.725, 0.825 mmol·L-1；C：Betaine濃度梯度The gradient of Betaine concentration，3-7: 0.4, 0.7, 1.0, 1.3, 1.6 mol·L-1；D：溫度梯度The gradient of temperature，3-8: 59, 61, 63, 65, 67, 69℃；E：時(shí)間梯度The gradient of time，3-10：20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 min

2.3 特異性檢測(cè)

以分別含有SPVC、SPCSV、SPV2、SPLV、SPVG、SPCFV以及SPFMV病毒甘薯葉片的RNA為模板，利用普通RT-PCR和2.1優(yōu)化的RT-LAMP兩種方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，RT-LAMP和RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果一致，并且只能在攜帶SPFMV的甘薯樣品中擴(kuò)增出條帶，而攜帶其他病毒的甘薯樣品皆沒(méi)有擴(kuò)增到條帶（圖3），表明建立的SPFMV RT-LAMP檢測(cè)體系具有很好的特異性。

2.4 RT-LAMP與RT-PCR靈敏度比較

提取感染SPFMV甘薯葉片總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度為121.6 ng·L-1。將RNA按10倍梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，RT-LAMP在RNA原液、10-1—10-4稀釋液為模板下可擴(kuò)增到條帶，即本研究建立的SPFMV RT-LAMP方法檢測(cè)到目標(biāo)病毒的葉片RNA濃度最低為121.6×10-4ng·μL-1（圖4-A），而RT-PCR能在RNA原液、10-1—10-3稀釋液模板中擴(kuò)增到條帶，即RT-PCR方法檢測(cè)到目的病毒的葉片RNA濃度最低為121.6× 10-3ng·μL-1（圖4-B）。表明本研究建立的RT-LAMP方法較普通RT-PCR方法檢測(cè)靈敏度高10倍。

2.5 RT-LAMP技術(shù)的田間檢測(cè)應(yīng)用

對(duì)采自山東的甘薯疑似病株分別進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，12份樣品中（部分結(jié)果）利用RT-LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)出7份SPFMV陽(yáng)性樣品（圖5-B），與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致（圖5-A）。往RT-LAMP產(chǎn)物中加入SYVR green I核酸熒光染料，電泳檢測(cè)有條帶的樣品迅速變?yōu)榫G色，無(wú)條帶的樣品為橙色（圖5-C），與RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。綜上，表明本研究建立的RT-LAMP檢測(cè)方法可用于田間甘薯樣品SPFMV檢測(cè)。

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對(duì)照和空白對(duì)照Negative control and blank control；3-9: SPFMV, SPVC, SPCSV, SPV2, SPLV, SPVG, SPCFV

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對(duì)照和空白對(duì)照Negative control and blank control，3—10：RNA濃度分別為121.6、121.6×10-1、121.6×10-2、121.6×10-3、121.6×10-4、121.6×10-5、121.6×10-6和121.6×10-7 ng·μL-1 The concentration of RNA is 121.6, 121.6×10-1, 121.6×10-2, 121.6×10-3, 121.6×10-4, 121.6×10-5, 121.6×10-6 and 121.6×10-7 ng·μL-1, respectively

3 討論

SPFMV是全球影響甘薯的最具破壞性的病毒之一，其寄主植物廣泛，對(duì)甘薯的危害尤其嚴(yán)重[1-9]。由于甘薯主要為營(yíng)養(yǎng)繁殖，容易造成病毒的逐年積累，造成甘薯產(chǎn)量降低，品質(zhì)變劣和種性退化，嚴(yán)重危害甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。近年來(lái)地域間種質(zhì)資源的頻繁交流，也促使甘薯病毒病發(fā)生擴(kuò)散[1-3]。因此，加強(qiáng)早期預(yù)警和種薯種苗的檢驗(yàn)檢疫，對(duì)防止甘薯病毒病的傳播具有重要意義。目前，針對(duì)SPFMV的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)有很多，包括常規(guī)RT-PCR、熒光定量PCR、血清學(xué)檢測(cè)等，但多有操作繁雜、耗時(shí)較長(zhǎng)等特點(diǎn)[10-14]。RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)是一種新型的檢測(cè)技術(shù)，具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)和動(dòng)植物的各種病原微生物的快速診斷和檢測(cè)[16-30]。2013年，喬奇等[27]建立的SPCSV RT-LAMP檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)SPCSV的快速檢測(cè)。本研究建立了針對(duì)SPFMV的RT-LAMP檢測(cè)體系，僅需70 min即可獲得檢測(cè)結(jié)果，并可通過(guò)熒光顯色劑直接觀察結(jié)果，不需要借助復(fù)雜儀器設(shè)備，節(jié)約了大量的成本和檢測(cè)時(shí)間，適合在基層檢測(cè)部門(mén)中廣泛應(yīng)用。

M：DL2000 DNA marker；1、2：陰性對(duì)照和空白對(duì)照Negative control and blank control；3—14：田間采集的甘薯樣品sweet potato samples collected in the field

多種甘薯病毒共同侵染時(shí)，一般具有協(xié)生作用[31-34]。作為中國(guó)甘薯的主要病毒，SPFMV常與其他多種病毒發(fā)生復(fù)合侵染現(xiàn)象，導(dǎo)致葉片扭曲、畸形和植株矮化等嚴(yán)重癥狀，使甘薯產(chǎn)量損失嚴(yán)重，對(duì)甘薯造成毀滅性危害[1,4-5]。但當(dāng)SPFMV單獨(dú)侵染甘薯時(shí)，植株體內(nèi)病毒含量較低，引起的癥狀輕微，難以直接進(jìn)行診斷鑒定[34]。對(duì)SPFMV的發(fā)生進(jìn)行早期預(yù)警，可有效減少甘薯病毒病害造成的損失。本研究建立并優(yōu)化的RT-LAMP體系具有高特異性和靈敏度，針對(duì)同屬病毒侵染的樣品，也實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確檢測(cè)，且比常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度高10倍。筆者實(shí)驗(yàn)室利用RT-LAMP對(duì)山東多地采集的145份甘薯疑似病樣進(jìn)行鑒定，其中檢測(cè)到SPFMV陽(yáng)性樣品83份，發(fā)病率達(dá)57.24%（完整結(jié)果未提供），對(duì)病毒含量較低的樣品也可有效檢測(cè)。表明建立的SPFMV RT-LAMP檢測(cè)方法具有快速、高效的特點(diǎn)，為種薯、種苗和脫毒苗的檢測(cè)和鑒定提供了有利的技術(shù)支持。

4 結(jié)論

建立了SPFMV的RT-LAMP檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的可視化，具有簡(jiǎn)單、快速、特異和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，適于科研機(jī)構(gòu)和基層檢測(cè)部門(mén)使用。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Development of RT-LAMP Assay for Rapid Detection of(SPFMV)

JIANG ShanShan, FENG Jia, ZHANG Mei, WANG ShengJi, XIN ZhiMei, WU Bin, XIN XiangQi

(Laboratory of Plant Virology, Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100)

【】(SPFMV) is an important virus infecting sweet potato plants. The objective of this study is to establish a rapid and efficient method for the detection of SPFMV by using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) method.【】Four specific RT-LAMP primers for SPFMV detection including SPFMV-FIP (5′-TAAGCGCGGCTGCCTTCATC-CATTCAACCACCCCTGCA-3′), SPFMV-BIP (5′-TCGGTTGTTTGGT TTGGACGGA-ATCAGTTGTCGTGTGCCTC-3′), SPFMV-F3 (5′-GAGTCTTGCGCGATATGCA-3′) and SPFMV-B3 (5′-ACCCC TCATTCCTAAGAGGT-3′) were designed by Primer Explorer V4 according to the nucleotide sequence of SPFMV coat protein (CP) gene in GenBank as well as two specific reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) primers for SPFMV detection including SPFMV-F (5′-TCTAATGAGAACACTGAATT-3′) and SPFMV-R (5′-TTGCACACCCCTCATTCCTAAG-3′). Different reaction conditions were optimized in the RT-LAMP in order to improve specificity and sensitivity of the detection, including the primers concentration ratios of F3/B3 to FIP/BIP (1﹕1, 1﹕2, 1﹕4, 1﹕6, 1﹕8 and 1﹕10), dNTPs concentrations (0.025, 0.125, 0.225, 0.325, 0.425, 0.525, 0.625, 0.725 and 0.825 mmol·L-1), Betaine concentrations (0.4, 0.7, 1.0, 1.3 and 1.6 mol·L-1), reaction temperatures (59, 61, 63, 65, 67 and 69℃) and reaction times (20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 and 90 min). The best reaction conditions were confirmed according to the test results of agarose gel electrophoresis. The RT-LAMP products were identified by sequencing and enzyme analysis. The detection specificity of RT-LAMP was tested by using different RNA templates from SPFMV,C (SPVC),(SPCSV),2 (SPV2),(SPLV),G (SPVG),(SPCFV) and leaf sample of healthy sweet potato plant. The sensitivities of RT-LAMP and RT-PCR for detecting SPFMV were compared by using ten-fold serially diluted RNA templates of SPFMV (including original RNA, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6and 10-7dilutions). Finally, the optimized RT-LAMP and RT-PCR were used to detect the samples of SPFMV collected from Shandong Province. 【】The RT-LAMP rapid detection method of SPFMV was established and the optimal amplification was achieved by incubation of 0.8 μmol·L-1SPFMV-FIP/SPFMV-BIP, 0.2 μmol·L-1SPFMV-F3/SPFMV-B3, 0.325 mmol·L-1dNTPs, 1 mol·L-1Betaine with template RNA at 65℃ for 70 min. The specificity test showed that the RT-LAMP method established in this study could amplify the typical ladder-like bands only to the RNA carrying SPFMV. The lowest detectable RNA concentration of RT-LAMP was 121.6×10-4ng·μL-1, while the lowest detectable RNA concentration of RT-PCR was 121.6×10-3ng·μL-1, indicating that the sensitivity of RT-LAMP was 10 times higher than RT-PCR for detecting SPFMV. The optimized RT-LAMP method was applied to the detection of SPFMV in field samples and the results were consistent with the visual inspection of RT-LAMV products. It suggested that the RT-LAMP detection method could be applied to detect the SPFMV in the field.【】The RT-LAMP established in this study has high sensitivity and speci?city, and is suitable for rapid detection of SPFMV in the field.

sweet potato;(SPFMV); RT-LAMP; detection

2017-09-29；

2017-12-12

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016GNC111003）、國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303028）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2016B11）

姜珊珊，E-mail：shanshan2113@163.com。

辛相啟，E-mail：xinxiangqi@126.com