食糜特性的評(píng)價(jià)指標(biāo)和測(cè)定方法

王　瑞　劉來亭　牛小偉

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

食糜是胃腸道中內(nèi)容物的總稱，是食物在消化道中經(jīng)機(jī)械性消化變成的細(xì)碎顆粒，并混有消化液、微生物及其發(fā)酵產(chǎn)物等呈半流體或流體樣的混合物。目前對(duì)食糜特性的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有：黏度、pH、粒度、流量和滯留時(shí)間、持水力、消化酶活性和微生物菌群。

1　黏　度

食糜黏度是影響動(dòng)物對(duì)飼料消化程度的一個(gè)重要指標(biāo)，黏度增加，溶質(zhì)的擴(kuò)散速度下降，食糜的消化速度減慢，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從飼料中溶出的速度減慢，飼料消化率降低[1]。動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中所研究的黏度是動(dòng)力黏度，也稱相對(duì)黏度，通常采用黏度計(jì)測(cè)定，方法為：采用某種分離方法將食糜中的液相和固相進(jìn)行分離，采用黏度計(jì)對(duì)分離出的液相進(jìn)行黏度測(cè)定，最終的黏度以食糜樣品流出時(shí)間與同體積蒸餾水流出時(shí)間的比值來表示。

實(shí)際應(yīng)用中，研究者對(duì)食糜樣品的前處理不盡相同，湯海鷗等[2]在食糜樣品中加入10 mL蒸餾水；霍文穎等[3]則將食糜稀釋6倍；Lzaro等[4]未對(duì)樣品進(jìn)行稀釋處理。另外，在分離液相和固相時(shí)所采用的離心速度也不相同，如湯海鷗等[2]、霍文穎等[3]采用的轉(zhuǎn)速為5 000 r/min；呂秋鳳等[5]則采用3 000 r/min；劉長(zhǎng)忠等[6]采用12 000 r/min。由此可以看出，同一測(cè)定方法在具體應(yīng)用上有很大差異，這樣的差異對(duì)結(jié)果的影響到何種程度，目前未見報(bào)道。

2　pH

食糜pH是影響動(dòng)物消化吸收的重要因素之一，也是食糜的一個(gè)重要指標(biāo)。pH會(huì)嚴(yán)重影響胃腸道中的消化酶活性和胃液的分泌，從而影響動(dòng)物消化[7]，其測(cè)定大都采用酸度計(jì)，方法為：將食糜中的液相和固相進(jìn)行離心分離后，測(cè)定其液相部分的pH。

在pH測(cè)定中對(duì)樣品的前處理也有如黏度測(cè)定時(shí)同樣的問題，艾曉杰等[7]、毛宗林等[8]未對(duì)食糜樣品進(jìn)行稀釋處理；呂秋鳳等[5]則對(duì)樣品進(jìn)行了10倍稀釋。存在的問題是食糜pH測(cè)定時(shí)如何對(duì)樣品進(jìn)行前處理，不同前處理是否會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生偏差，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

3　?！《?/h2>

食糜粒度是食糜的重要物理特性，通常采用粒徑或粒度分布來表示其粒度的大小。飼料最適顆粒大小分布應(yīng)適應(yīng)動(dòng)物的生理需求，能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的利用率達(dá)到最佳，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能[9]。其測(cè)定方法通常有2種：1)篩分法，原理為通過選擇一系列不同孔徑的標(biāo)準(zhǔn)篩，按孔徑大小自上而下依次放置進(jìn)行篩分，篩分結(jié)束后通過稱重的方式確定各孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩中得到的顆粒重量，由此求得以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示的顆粒粒徑分布[10]；2)激光散射法，原理為以足夠的濃度分散在合適的液體或者氣體里的樣品通過由單色光源(通常是激光)產(chǎn)生的光束，多元探測(cè)器測(cè)量粒子在任意角度的光散射，與散射模型相關(guān)的數(shù)值被記錄下來用作后續(xù)的分析。這些散射數(shù)據(jù)通過恰當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)模型和數(shù)學(xué)過程(米氏散射理論和弗朗霍夫近似理論)轉(zhuǎn)化，生成不同的離散尺寸級(jí)數(shù)相對(duì)于整體積的比例，組成粒子尺寸分布[11]。

進(jìn)行2種方法相關(guān)性的對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，篩分法適合測(cè)定粒徑更大的顆粒(>45 μm)；激光散射法的測(cè)定范圍廣(0.02～2 000.00 μm)、分辨率高、檢測(cè)速度快，因此激光散射法更加適用[12]。

4　流量和滯留時(shí)間

食糜流量和滯留時(shí)間均為食糜的重要物理特性。食糜流量可以表征營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，在某一消化部位，流量越大，說明其在胃腸道的這一部位消化吸收量越大；相反其被消化吸收的量越小[13]。滯留時(shí)間通常用來表征某一飼料成分(多為飼料纖維含量)對(duì)食糜理化特性的改變[14]。目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的測(cè)量食糜流量的方法有全收集法和指示劑法，全收集法是通過小腸體外吻合瘺管收集食糜，能夠準(zhǔn)確測(cè)定食糜總量，但其收集技術(shù)較繁瑣、費(fèi)人力，且試驗(yàn)動(dòng)物不易護(hù)理、存活時(shí)間短[15]；指示劑法以指示劑在胃腸道中的流量以及指示劑的滯留時(shí)間等效替代食糜的流量和滯留時(shí)間[16]。指示劑對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的應(yīng)激小，因此指示劑法最受歡迎[15]。指示劑法使用的關(guān)鍵是選用適當(dāng)?shù)闹甘緞ｊP(guān)于內(nèi)源和外源指示劑的測(cè)定結(jié)果也有許多報(bào)道，高新梅等[17]認(rèn)為用外源指示劑鉻(Cr)作為飼料標(biāo)記物時(shí)，發(fā)現(xiàn)無法排除飼料因素與被測(cè)飼料的互作效應(yīng)；Barnett等[18]采用乙二胺四乙酸二鈷(Co-EDTA)外源指示劑作為標(biāo)記物測(cè)定食糜流量，發(fā)現(xiàn)結(jié)果的變異系數(shù)為5.1±2.0，說明其作為標(biāo)記物具有一定的可靠性；張乃峰等[19]分別用外源指示劑三氧化二鉻(Cr2O3)和聚乙二醇(PEG)-4000作為標(biāo)記物測(cè)定食糜流量，發(fā)現(xiàn)Cr2O3作為標(biāo)記物可以得到更合理的結(jié)果；Solà-Oriol等[20]認(rèn)為用二氧化鈦(TiO2)標(biāo)記的食糜比Cr標(biāo)記的食糜流通速度快；張乃鋒[21]用Cr2O3作為固相標(biāo)記物，PEG作為液相標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)雙標(biāo)記法測(cè)得的食糜流量變異系數(shù)較小，穩(wěn)定性與可靠性更好；Faichney[22]使用Cr作為標(biāo)記物研究甲醛處理飼糧對(duì)綿羊胃腸道溶質(zhì)和顆粒物流量的影響，發(fā)現(xiàn)4.9%的Cr被吸收到尿液中，說明部分Cr被機(jī)體吸收代謝?？梢钥闯?，所用的標(biāo)記物都不盡相同，以標(biāo)記物的種類為變量進(jìn)行探究試驗(yàn)有助于找出更適用的標(biāo)記物。

5　持水力

食糜持水力是指食糜對(duì)自身水分的保持能力和對(duì)外加水分的親合能力，又稱保水性。食糜的持水力會(huì)影響到食糜黏度[23]。食糜持水力的測(cè)定方法有2種：1)烘干法，是將食糜樣品離心后取沉淀，進(jìn)行105 ℃烘干，以烘干減少重量與烘干后重量的比值來表示持水力[24]；2)離心法，是將食糜樣品以2 500 r/min離心10 min，棄去上清液，稱取離心管重量，以離心后減少重量與離心后沉淀重量的比值來表示持水力[25]。

目前對(duì)于以上2種方法孰優(yōu)孰劣還尚無定論，可以分別利用這2種方法針對(duì)同一物質(zhì)的持水力進(jìn)行測(cè)定，以比較出哪種方法更科學(xué)、更適用。

6　消化酶活性

食糜消化酶活性是食糜最重要的特性指標(biāo)之一，是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的重點(diǎn)，是影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的關(guān)鍵因素，消化酶活性增加能提高動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率[26]。目前，測(cè)定食糜消化酶活性時(shí)重點(diǎn)檢測(cè)淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、麥芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶和羧甲基纖維素酶的活性[27-29]。酶活性的測(cè)定原理為：利用酶能專一而高效催化化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，通過測(cè)定酶促反應(yīng)速度來檢測(cè)樣品中某種酶的含量和活性?，F(xiàn)行的酶活性測(cè)定方法有很多，不同的酶活性采用的方法也不同。淀粉酶活性測(cè)定采用碘-淀粉比色法；脂肪酶活性測(cè)定采用比濁法；胰蛋白酶活性測(cè)定采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)法；總蛋白酶活性測(cè)定采用福林-酚法。概括為分光光度計(jì)法、旋光法、熒光法和化學(xué)反應(yīng)法，相對(duì)來說分光光度計(jì)法是較為常用的酶活性檢測(cè)方法。總之，酶活性的測(cè)定方法逐漸向簡(jiǎn)單化、高精度、重復(fù)性強(qiáng)的方向發(fā)展，所以基于酶標(biāo)儀檢測(cè)的試劑盒法已成為目前應(yīng)用較多的方法；如史東杰等[30]對(duì)錦鯉胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性的測(cè)定；林廈菁等[31]對(duì)肉雞脂肪酶、淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性的測(cè)定；王國(guó)霞等[32]對(duì)花鱸蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的測(cè)定；付旭等[33]對(duì)淡黑鑷麗魚胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的測(cè)定。該方法的特點(diǎn)是將樣品進(jìn)行前處理后，采用廠家提供的試劑盒，并按照試劑盒中指定方法進(jìn)行；該方法操作簡(jiǎn)便、專業(yè)化程度高、精確度高。測(cè)定的主要步驟為：將食糜樣品用一定體積的0.86%的氯化鈉溶液(勻漿液)進(jìn)行稀釋、勻漿，低溫超速離心機(jī)4 ℃下3 000 r/min離心20 min，取上清液，按照相關(guān)酶活性測(cè)定試劑盒的操作說明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度值檢測(cè)，從而得出酶活性。

7　微生物菌群

食糜微生物菌群即腸道微生態(tài)系統(tǒng)是食糜最重要的指標(biāo)之一。食糜微生物菌群的平衡對(duì)動(dòng)物養(yǎng)分代謝、機(jī)體免疫、促進(jìn)動(dòng)物健康及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用等方面起著重要作用，研究食糜微生物菌群有益于揭示胃腸道消化吸收和代謝的作用機(jī)理[34-35]。

傳統(tǒng)測(cè)定食糜微生物菌群采用平板計(jì)數(shù)法，即在無菌環(huán)境中取一定量腸道內(nèi)容物，用磷酸鹽緩沖液10倍遞度稀釋至10-6，選擇合適的稀釋梯度分別滴種于各選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其數(shù)量用每克腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)[lg(CFU/g)]來表示。根據(jù)細(xì)菌在相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基上所形成的菌落特征，結(jié)合革蘭氏染色及鏡檢對(duì)其進(jìn)行鑒定。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，食糜微生物菌群的分子生物學(xué)研究方法得到廣泛應(yīng)用，目前采用較多的是變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RLFP)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)和宏基因組技術(shù)。這些技術(shù)在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用研究也較來越多，Simpson等[36]將DGGE技術(shù)用于檢測(cè)豬糞便微生物菌群的組成；Kocherginskaya等[37]研究了閹公牛瘤胃液樣品的DGGE圖譜；張永婧等[38]利用T-RLFP技術(shù)研究了不同纖維來源的飼糧和細(xì)胞壁降解酶對(duì)豬腸道微生物菌群多樣性及其組成結(jié)構(gòu)的影響；潘艷艷等[39]運(yùn)用T-RLFP技術(shù)分析了鱸魚前腸壁、中腸壁、后腸壁及糞便中的細(xì)菌群落特征及其多樣性；Shtriker等[40]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)小鼠的腸道微生物菌群進(jìn)行了分析；基因芯片技術(shù)在傳統(tǒng)印跡雜交的基礎(chǔ)上，用1個(gè)試驗(yàn)可以監(jiān)控成千基因的表達(dá)，Luo等[41]使用基因芯片技術(shù)探究了豬糞便微生物菌群多樣性的差異；吳鵬等[42]應(yīng)用宏基因組技術(shù)研究了瘤胃微生物多樣性及功能；Nielsen等[43]使用宏基因組技術(shù)對(duì)豬糞便中微生物多樣性及其功能進(jìn)行了研究。雖然分子生物學(xué)方法較傳統(tǒng)方法有不可代替的優(yōu)點(diǎn)，但也存在樣品保存問題、樣品DNA的質(zhì)量問題和純化等問題[44]。

8　結(jié)　論

食糜和腸道是動(dòng)物消化吸收最重要的2個(gè)方面，有關(guān)腸道的研究比較多，有關(guān)食糜的狀態(tài)和特性對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用影響的研究相對(duì)較少，且目前評(píng)定食糜特性的指標(biāo)少，測(cè)定方法也存在差異，能客觀反映食糜特性的指標(biāo)還有待進(jìn)一步探討。食糜的形成和變化不但受飼料組成的影響，受腸道本身的影響也很大，科學(xué)評(píng)價(jià)食糜的理化特性和流變特性是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料加工研究的方向，這不但有助于研究達(dá)到動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最佳吸收狀態(tài)時(shí)食糜的特性，也為飼料配制、飼料加工、飼料原料以及添加劑的使用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。