“標本配穴”電針對心肌缺血模型大鼠心臟功能和細胞凋亡指數(shù)的影響

趙鋼,馬瑩瑩,付嘉明

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“標本配穴”電針對心肌缺血模型大鼠心臟功能和細胞凋亡指數(shù)的影響

趙鋼,馬瑩瑩,付嘉明

(黑龍江中醫(yī)藥大學,哈爾濱 150040)

通過“標本配穴”電針對針刺心肌缺血大鼠治療前后心臟功能和細胞凋亡指數(shù)影響的實驗研究,觀察治療療效,從而探討針刺預處理對心肌的保護機制,為臨床治療該病提供科學的方法。40只大鼠按隨機數(shù)字表分成正常組、模型組、內關組、標配組。采取連續(xù)14 d腹部皮下注射異丙腎上腺素造模。正常組、模型組大鼠只抓取固定,不針刺治療。內關組電針雙側內關,標配組電針雙側內關、關元、雙側足三里,每日治療1次,共21 d。大鼠于第22天行超聲心動圖機檢測大鼠左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室射血分數(shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS);TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)。模型組大鼠LVEDd、LVESD高于正常組(＜0.01),而LVEF、LVFS值均低于正常組(＜0.01);內關組和標配組LVEDd、LVESD均低于模型組(＜0.01),標配組低于內關組(＜0.01,＜0.05);內關組和標配組中LVEF、LVFS值均高于模型組(＜0.01),標配組高于內關組(＜0.05)。正常組大鼠心肌AI值低于模型組(＜0.01);內關組、標配組均低于模型組(＜0.01);標配組低于內關組(＜0.05)。電針能夠通過降低心肌缺血模型大鼠的LVEDd、LVESD值,提升LVEF、LVFS值,有效改善心肌缺血細胞凋亡導致的代償性心臟擴張、心功能低下,降低心肌細胞凋亡程度,且“標本配穴”電針法比單純內關電針法具有更好的效應。

標本配穴;電針;心肌缺血;心臟功能;細胞凋亡指數(shù);大鼠

現(xiàn)今心血管疾病嚴重威脅著人們的健康,其中心肌缺血是主要病因。針刺作為預防和治療心肌缺血的有效方法,為人們的健康提供了綠色的治療方案[1]。研究證明針刺對抗缺血心肌具有確切的保護作用,并且針刺不同腧穴或穴位配伍治療心肌缺血療效具有差異性。

心肌缺血發(fā)生后心臟室壁心肌組織、心腔結構及心臟功能發(fā)生改變,而針對性的治療可以有效地改善這些狀況[2]。本研究通過建立大鼠心肌缺血模型,觀察電針尤其是“標本配穴”電針法對大鼠心臟結構功能和心肌組織細胞凋亡狀況的影響,以期探索其對心臟的保護效果及保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本課題選用SPF級雄性Wistar大鼠40只,由青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。飼養(yǎng)室溫20～25℃,濕度50%～70%,體重180～220 g。實驗動物經(jīng)BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)檢測心電圖無異常。動物喂養(yǎng)于標準動物房,每籠5只。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后實驗。實驗過程嚴格遵照科技部(2006)398號《關于善待實驗動物的指導性意見》文件要求執(zhí)行[3]。

1.2 實驗動物分組及模型制備

40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、內關電針組(內關組)、標本配穴電針組(標配組),每組10只。模型組、內關組和標配組大鼠用鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenolhydrochloride,ISO)2 mg/ (kg·d)腹部皮下注射法[4-5],連續(xù)14 d,2周后用BL-420生物機能系統(tǒng)檢測模型組大鼠心電圖,以QRS波和QT波持續(xù)時間延長(QRS＞0.1 s)[6-7];ST段壓低(ST＞0.1 mV),T波倒置,作為造模成功的標志[8];正常組大鼠給予等量0.9%生理鹽水皮下注射,連續(xù)14 d。模型制備過程中無實驗大鼠脫落。

參照李忠仁主編的《實驗針灸學》[9]取穴,內關位于大鼠前臂下1/6折點處,尺、橈骨縫中,腕橫紋正中上5 mm處,針刺深度約2 mm;關元位于大鼠兩后肢根部連線的中點,針刺深度約4 mm;足三里位于大鼠膝關節(jié)后外側,腓骨小頭下約5 mm處,針刺深度約8 mm。

造模后穿自制大鼠固定衣[10],正常組、模型組大鼠只抓取固定,不針刺治療;內關組針刺雙側內關,標配組針刺內關、關元、足三里,標配組同側穴位組成一對電極,內關組及標配組單穴在穴位右旁開5 mm處另皮下淺刺一針,作為輔助電極;針刺后連接G6805-Ⅱ電針儀,選連續(xù)波,頻率2 Hz,電流強度均為1 mA,強度以大鼠出現(xiàn)與電針頻率相一致的輕微顫動為宜,通電20 min。每日治療1次,共21 d。

1.3 結果檢測

1.3.1 心臟結構與功能觀測

超聲心動圖檢測[11]大鼠左室舒張末期、收縮末期內徑、左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率。大鼠在第22天,經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉,以備皮刀心前區(qū)剃毛,仰臥固定于鼠板上,應用Agilent Sonos 5500型彩色超聲心動圖診斷儀,10S探頭,頻率為8 MHz,對大鼠的心臟大小及功能進行檢測[12]。檢測指標包括左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic diameter,LVESD),并計算出左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)[13]。

1.3.2 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)

大鼠在檢測心臟彩超后,開胸暴露心臟,迅速摘取大鼠心臟用生理鹽水清洗,取心尖組織置于4%多聚甲醛固定備用[14]。檢測步驟如下,①將大鼠心室切片100 mg,將其先后用二甲苯、無水乙醇、乙醇(95%、85%、75%梯度脫蠟水化)依次進行浸泡,再用蒸餾水浸泡洗滌2 min。②洗滌后的標本滴入20mg/mL的蛋白酶K液,在20～37℃條件下反應15 min,然后用PBS洗滌3次,每次洗滌5 min。③將裝有檢測標本的EP管中添加50mL TUNE反應液,在37℃條件下避光孵育60 min,然后放入PBS液中洗滌3次,每次洗滌5 min。④然后在標本上加入50mL過氧化物酶,在37℃條件下避光孵育30 min。⑤再用PBS液洗滌4次,每次5 min,然后添加100mL DAB的顯色液,在室溫下進行5 min的顯色,后用純凈水洗滌使顯色終止。⑥將顯色后的標本復染,時間控制在30 s至1 min之間,然后用水洗滌,再用1%鹽酸乙醇使之分化,后用純凈水沖洗使之返藍。⑦將復染后的標本用95%乙醇進行脫水,時間為5 min,后用無水乙醇反復脫水2次,每次時間為3 min,二甲苯透明2次,每次時間為2 min,后將標本放入通風櫥中進行風干,用中性樹膠對標本進行封片[15]。⑧利用顯微鏡觀察晾干后的標本切片。組織切片上的凋亡細胞在顯微鏡下(放大倍數(shù)為100倍和400倍)為棕褐色,采用計數(shù)方式標記出標本中心肌凋亡細胞與正常細胞的數(shù)目,后計算出細胞的凋亡率[16]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示,并對各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性分析,根據(jù)實驗數(shù)據(jù)的類型分析結果選擇相應的分析方法,依次采用單因素方差分析(-法)或運用-非參數(shù)秩和檢驗分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電針對心肌缺血大鼠心臟功能的影響

模型組的左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室收縮末期內徑(LVESD)均高于正常組(＜0.01),左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)均低于正常組(＜0.01)。內關組、標配組中LVEDd值均低于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(＜0.01);標配組中LVEDd值低于內關組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(＜0.01)。內關組、標配組中LVESD值均低于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(＜0.01);標配組中LVESD值低于內關組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。內關組、標配組中EF值均高于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(＜0.01);標配組中EF值高于內關組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。內關組、標配組中FS值均高于模型組,組間比較差異具有顯著統(tǒng)計學意義(＜0.01);標配組中FS值高于內關組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠LVEDd、LVESD、EF、FS值比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.05,2)＜0.01;與模型組比較3)＜0.01;與內關組比較4)＜0.05

2.2 電針對心肌缺血大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)的影響

模型組大鼠心肌細胞AI值均高于正常組,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(＜0.01)。內關組、標配組大鼠心肌細胞AI值均低于模型組,差異具有顯著統(tǒng)計學意義(＜0.01);標配組心肌細胞AI值低于內關組,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。詳見表2。通過組織染色看出標配組與內關組均能有效地改善實驗大鼠的心肌缺血情況下心臟生理及心肌功能低下的狀況,并且標配組電針法治療具有更好的療效。詳見圖1。

表2 各組大鼠AI值比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與內關組比較3)＜0.05

3 討論

3.1 大鼠處于心肌缺血狀態(tài)時心臟結構變化及選穴原則

持續(xù)、嚴重的心肌缺血將造成大鼠心肌細胞出現(xiàn)大量的凋亡,進而可導致心臟結構特別是左心室的構型發(fā)生病變,表現(xiàn)為缺血區(qū)的心室肌出現(xiàn)代償性增厚,致使左心室腔隙發(fā)生縮小[17],進而導致心室肌力減退,泵血功能下降,造成血液動力學障礙和心功能降低[18];電針“標本配穴”法治療心肌缺血的總有效率達80%以上[19],通過“標本配穴”治療既可以顯著地緩解大鼠心肌缺血引發(fā)的心絞痛癥狀,還可以有效地改善大鼠的心電圖及心臟功能,減少心肌細胞的凋亡[20]。腧穴配伍是針灸處方的主要內容之一,其目的是加強腧穴間協(xié)同作用,提高療效。不同腧穴有其特異性,實驗研究顯示[21],“標本配穴”法是現(xiàn)今電針抗大鼠心肌缺血損傷的最優(yōu)方法,其顯效率優(yōu)于常規(guī)配穴法。

3.2 “標本配穴”可以有效防治心肌缺血損傷

近來有采用中藥貼敷、穴位注射中藥、激光穴位治療、穴位埋針以及穴位按摩等方法,與其相比針刺“標本配穴”法治療心肌缺血的臨床顯效時間最快、強度可控[21]、物理損傷小并可以增加機體的適應性保護能力改善心肌缺血損傷[22]。

注:A為正常組,B為模型組,C為內關組,D為標配組。標本Harris蘇木素染色,組織切片在顯微鏡下(×400倍)觀察凋亡細胞為棕褐色

通過“標本配穴”法治療可以明顯減輕心肌缺血所引起的癥狀;并且心肌細胞凋亡指數(shù),可以用數(shù)據(jù)表現(xiàn)出大鼠心肌缺血后心臟出現(xiàn)代償及心功能低下的情況。針刺可以提升心肌組織的活性,并通過有效抑制缺血細胞凋亡發(fā)揮防護作用?！皹吮九溲ā狈娽樋赡芡ㄟ^兩方面途徑共同參與防治心肌缺血,一方面改善左心室射血分數(shù)(EF)和左心室短軸縮短率(FS),并抑制左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室收縮末期內徑(LVESD),從而提高心肌細胞抗損傷能力;另一方面降低心肌細胞凋亡指數(shù)(AI),減少心肌細胞凋亡,減輕心室結構功能損傷。實驗表明,通過“標本配穴”電針法能夠預防及治療缺血性心臟病,并服務于臨床。

3.3 問題與展望

心肌缺血導致的心肌組織細胞凋亡信號通路研究是一個紛繁復雜的調節(jié)網(wǎng)絡[23],而對這些信號通路進行系統(tǒng)的研究是個復雜龐大的工程。針灸防治心肌缺血性心血管疾病也是一個多通道、多靶點的調控機制[24],每條信號調控途徑也并非獨自發(fā)揮調控作用。本研究中只探討“標本配穴”對心肌缺血模型大鼠心臟結構、功能和細胞凋亡指數(shù)對大鼠心肌缺血的影響,對于分子機制尚未深入剖析。下一步研究可從兩個方面進行,一是對心肌缺血過程中相關的基因分子水平調控途徑進行研究,探討已經(jīng)進行科研的研究,找出關鍵基因;二是找出對心肌缺血具有直接的影響可能存在的未知的靶基因,為心肌缺血過程中的調控機制進行更清晰的闡釋[25]。

綜上所述,“標本配穴”電針法具有良好的抗心肌缺血的作用,其機制可能是通過針刺腧穴后的改善心室結構、功能,抑制心肌細胞發(fā)生凋亡,從而達到有效保護心肌的效果。

[1] 董曉瑞.中西醫(yī)結合方法防治心血管疾病[J].中國醫(yī)藥指南,2017,15(8):201.

[2] 戴翠蓮,羅開良,姜黔峰,等.蛋白酶體抑制劑對急性心肌缺血再灌注大鼠心臟結構及功能的影響[J].重慶醫(yī)科大學學報,2010,35(10):1486-1489.

[3] 史曉萍,宗阿南,陶鈞,等.《關于善待實驗動物的指導性意見》的研究[J].中國醫(yī)科大學學報,2007,36(4): 493.

[4] 高海成,孫波,苗春生,等.大劑量鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌缺血性壞死模型的建立[J].中國生物制品學雜志,2009,22(3):288-290.

[5] 王華,望廬山,梁鳳霞,等.電針治療對慢性心肌缺血大鼠心電圖、心肌病理形態(tài)及PI3K/Akt信號通路的影響[J].中國針灸,2016,36(4):389-395.

[6] 謝俊,陳澤斌,吳松,等.不同腧穴配伍電針防治大鼠心肌缺血損傷作用的比較[J].針刺研究,2017,42 (2):131-135.

[7] Gao J, Fu W, Jin Z, et al. Acupuncture pretreatment protects heart from injury in rats with myocardial ischemia and reperfusion via inhibition of the beta(1)- adrenoceptor signaling pathway[J]. Life Sci, 2007,80 (16):1484-1489.

[8] 韓軍,宣佳利,胡浩然,等.金絲桃苷預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷作用與PI3K/Akt信號通路的關系[J].中國中藥雜志,2015,40(1):118-123.

[9] 李忠仁.實驗針灸學[M].第2版,北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:23.

[10] 袁建菱,劉麗,陳小麗,等.一種大鼠固定器:中國, CN201620354700.5[P].2016-11-9.

[11] 寶云龍,曹憲玉,金天亮,等.高頻超聲心動圖與血流動力學檢測結合評價擴張型心肌病心力衰竭大鼠心功能實驗研究[J].中國分子心臟病學雜志,2015,15 (1):1210-1213.

[12] 路愛青,李全太,孫作忠.經(jīng)胸超聲心動圖、心電圖、多層螺旋CT冠狀動脈造影診斷冠心病的對比研究[J].功能與分子醫(yī)學影像學雜志(電子版),2015,4(1): 583-587.

[13] Uusitalo V, Luotolahti M, Pietil? M,. Two- dimensional speckle-tracking during dobutamine stress echocardiography in the detection of myocardial ischemia in patients with suspected coronary artery disease[J]., 2016,29(5):470- 479.

[14] 祝曉瑩,王桂美,胡敏,等.硫化氫活化ERK抵抗內質網(wǎng)應激誘導的心肌細胞凋亡[J].華中科技大學學報(醫(yī)學版),2015,44(3):251-257,262.

[15] 袁芳.山楂葉總黃酮對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞凋亡及bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2016,18(8):42-45.

[16] 王華,盧繼東,吳松,等.電針不同腧穴對心肌缺血模型大鼠細胞凋亡及心肌細胞miRNAs表達的影響[J].中國針灸,2016,36(3):281-286.

[17] 馮艷紅,孫海龍,周宇微,等.川穹嗪對急性心肌梗死大鼠心肌的保護作用及機制探討[J].山東醫(yī)藥,2013,53 (10):11-13.

[18] Reiter M, Twerenbold R, Reichlin T,. Early diagnosis of acute myocardial infarction in the elderly using more sensitive cardiac troponin assays[J]., 2011, 32(11):1379-1389.

[19] 老錦雄,潘清潔.背俞穴溫針灸對冠心病無癥狀性心肌缺血患者心電圖及血液動力學的影響[J].針灸臨床雜志,2012,28(7):37-39.

[20] 吳紅金,郭歡,謝芳.針刺抗心肌缺血機制的實驗與臨床研究現(xiàn)狀[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2005,3 (5):430-431.

[21] 郭新榮,李娜,吳濤,等.針刺對顱腦損傷模型大鼠血清及腦組織中SOD、MDA含量的影響[J].山東中醫(yī)雜志, 2013,32(6):423-424.

[22] 王潔.針刺不同配穴對心肌缺血大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB表達的影響[D].安徽中醫(yī)藥大學,2015.

[23] 李光,邢小燕,張美雙,等.基于表觀遺傳學調控的中醫(yī)藥防治心肌缺血再灌注損傷的研究進展[J].藥學學報, 2016,51(7):1047-1053.

[24] 王思穎.通心絡對大鼠心肌梗死缺血區(qū)微血管新生及纖維化的作用機制研究[D].北京中醫(yī)藥大學,2016.

[25] 杜建奎.MicroRNA-22加重心肌缺血-再灌注損傷的作用及其機制研究[D].第二軍醫(yī)大學,2016.

Effect of “Secondary-primary Point Combination” Electroacupuncture on Cardiac Function and Apoptosis Index in a Rat Model of Myocardial Ischemia

150040,

To investigate the efficacy of “secondary-primary point combination” electroacupuncture by observing its effect on cardiac function and apoptosis index in myocardial ischemia rat to explore the mechanism by which acupuncture pretreatment protects cardiac muscles and provide a scientific method for clinical treatment of this disease.Forty rats were allocated, using a random number table, to normal, model, Neiguan and secondary-primary point combination groups. The model was made by 14 consecutive days of abdominal subcutaneous injection of isoprenaline. The normal and model groups were only grabbed and fastened and not given acupuncture. The Neiguan group received acupuncture at bilateral points Neiguan(PC6) and the secondary-primary point combination group, at point Guanyuan(CV4) and bilateral points Neiguan and Zusanli(ST36). Acupuncture was given once daily, for a total of 21 days. Left ventricular end-diastolic diameter (LVEDd), Left ventricular end-systolic diameter (LVESD), left ventricular ejection fraction (EF) and left ventricular fractional shortening (FS) were measured by echocardiography in the rats at day 22. Rat myocardial apoptosis index (AI) was determined by TUNEL.Cardiac LVEDd and LVESD were larger and EF and FS were lower in the model group than in the normal group (all＜0.01). LVEDd and LVESD were smaller in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and smaller in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.01,＜0.05), EF and FS were higher in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and higher in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.05). Rat myocardial AI was lower in the normal group than in the model group (＜0.01), lower in the Neiguan and secondary-primary point combination groups than in the model group (＜0.01) and lower in the secondary-primary point combination group than in the Neiguan group (＜0.05).Electroacupuncture can effectively alleviate compensatory cardiac dilatation and cardiac hypofunction caused by ischemic myocardial cell apoptosis and reduce myocardial cell apoptosis by decreasing LVEDd and LVESD and increasing EF and FS in a rat model of myocardial ischemia. “Secondary-primary point combination” electroacupuncture has a better effect than electroacupuncture at point Neiguan alone.

Secondary-primary point combination; Electroacupuncture; Myocardial ischemia; Cardiac function; Apoptosis index; Rats

R2-03

A

1005-0957(2018)04-0461-05

趙鋼(1958—),男,教授,Email:174625809@qq.com

馬瑩瑩(1993—),女,2017級碩士生,Email:174625809@qq.com

付嘉明(1990—),男,2014級碩士生,Email:174625809@qq.com

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.04.0461

2017-10-20