香菜黃酮的提取優(yōu)化及其抗氧化活性的初步研究

賈洪信

(廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院，廣東 佛山　528216)

香菜(Coriandrumsativum)，別名芫荽、香荽等，傘形科，是具有強(qiáng)烈清香氣味的草本植物。香菜營(yíng)養(yǎng)豐富，每 100 g中含有碳水化合物 6.9 g，蛋白質(zhì) 20 g，鐵 5.6 mg，脂肪 0.3 g，鈣170 mg，磷 49 mg，VC41 mg，胡蘿卜素 3.77 mg，它的胡蘿卜素含量是菜豆、西紅柿、黃瓜的 10倍以上，鐵、鈣的含量也高于許多其他的葉類蔬菜，另外還含有硫胺素、尼克酸、核黃素以及揮發(fā)油、黃酮甙、右旋甘露糖醇等[1]，主要用于消化困難、膨脹等癥狀，還有鎮(zhèn)痛效果[2]。國(guó)內(nèi)外諸多研究表明：香菜還具有利尿[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]、抗氧化[6]、降糖、降脂、抑制鉛沉積、促毛發(fā)生長(zhǎng)等保健作用[7,8]。

黃酮類物質(zhì)是一類天然的抗氧化劑，在自然界中廣泛存在于各類蔬菜、水果及中草藥中。黃酮類化合物(flavonoids)，又名生物類黃酮化合物(bioflavonoids)，現(xiàn)泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)(A和B)通過(guò)中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。由于天然黃酮類化合物具有多種生物活性，所以國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)不同植物體進(jìn)行了大量黃酮類化合物的研究報(bào)道。楊洋等[9]比較了熱水提取法、堿液提取法和70%乙醇提取法3種方法對(duì)柚皮中黃酮類化合物的提取效率的影響；陳紅梅等[10]以微波法處理蓮房，蓮房黃酮得率為11.42%；張吉祥等[11]用微波法提取棗核，得到黃酮含量為7%；Cao 等[12]研究了纖維素酶輔助法在植物黃酮類化合物提取中的應(yīng)用；楊保求等[13]用纖維素酶酶解紅棗核，黃酮提取率為4.88 mg/g，比沒(méi)有添加酶的總黃酮提取率高24.3%；岳紅等[14]研究了超臨界CO2萃取柿葉黃酮的工藝。

香菜大多情況下用來(lái)食用，對(duì)其研究開(kāi)發(fā)較少。香菜相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分的分離和鑒定、干燥特性及貯藏品質(zhì)的影響、提取工藝優(yōu)化和栽培技術(shù)等[15-23]。目前，對(duì)于香菜的抗氧化方面的報(bào)道較少，田迪英等[24]發(fā)現(xiàn)香菜提取物都對(duì)魚油具有抗氧化作用，陳志紅等[25]研究香菜乙醇提取液對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基均有清除作用。因此本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定香菜黃酮的最佳提取條件，并進(jìn)行其抗氧化性能的測(cè)定。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料和試劑

新鮮香菜：購(gòu)于廣東省湛江市赤坎區(qū)市場(chǎng)；

蘆丁和VitC對(duì)照品：購(gòu)于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司購(gòu)買；

無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸、硫酸、磷酸三鈉、硫酸亞鐵、鉬酸銨、水楊酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2　試驗(yàn)儀器和設(shè)備

GX-3020干燥箱東莞市高鑫檢測(cè)設(shè)備有限公司；DJ-04B粉碎機(jī)上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司；FC104電子天平上海精科天平廠； DZKW-C型電子恒溫不銹鋼水浴鍋上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；723N可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；LG16-W離心機(jī)北京京立離心機(jī)有限公司；電冰箱廣東科龍電器股份有限公司；回流裝置等。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1香菜提取液的制備

香菜用自來(lái)水沖洗干凈，再用雙蒸水沖洗，晾干，80 ℃烘烤8 h，過(guò)40目篩粉碎得香菜粉末。稱量1 g香菜粉末，加95%乙醇25 mL，95 ℃回流2次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾，定容于50 mL容量瓶中，得到濃度為20 g/L的香菜提取液。

1.3.2單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別以回流溫度、回流時(shí)間和乙醇濃度為因素(見(jiàn)表1)，以香菜提取液的黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)確定各因素的最適范圍。

表1　單因素試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of single factor design

1.3.3正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(33)正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表2)，建立數(shù)字化模型，對(duì)香菜生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表2　正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of L9(33) orthogonal design

1.3.4黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測(cè)定樣品中黃酮的含量[26]。0.4 mL樣品與0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaNO2溶液室溫反應(yīng)6 min后，加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)3溶液混勻后反應(yīng)6 min，加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH溶液和5.0 mL蒸餾水充分混勻，反應(yīng)15 min后，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品(20～100 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0079x-0.037，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999。由回歸方程計(jì)算5倍稀釋提取液中黃酮的含量C(mg/L)，則香菜中總黃酮的含量(mg/g)=C×5/20。

1.3.5抗氧化活性的研究

1.3.5.1總抗氧化能力測(cè)定

采用磷鉬絡(luò)合法測(cè)定樣品的總抗氧化能力[27]。試管中依次加入3 mol/L H2SO4溶液2 mL、0.14 mol/L Na3PO4溶液2 mL和0.02 mol/L鉬酸銨溶液2 mL。再加入2 mL樣品，用蒸餾水定容至10 mL，混合均勻。加塞于95 ℃水浴中加熱90 min，取出冷卻后用空白(蒸餾水代替樣品)調(diào)零在695 nm波長(zhǎng)下測(cè)量。以VitC為標(biāo)準(zhǔn)品(40～120 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=8.085x-0.1219，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9991。

1.3.5.2還原能力的測(cè)定

取1.0 mL不同濃度的樣品，加入0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6) 2.5 mL和1% 鐵氰化鉀2.5 mL，混合均勻，于50 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min后急速冷卻；取出再加入10% 三氯乙酸2.5 mL[28]。而后于3000 r/min下離心10 min，取上清液2.5 mL加入蒸餾水2.5 mL，加1 mg/L三氯化鐵0.5 mL，混勻后用分光光度計(jì)于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以VitC為標(biāo)準(zhǔn)品(60～140 mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=5.337x+0.083，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9993。

1.3.5.3羥基自由基清除能力的測(cè)定

取2.0 mL不同濃度的樣品，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、6 mmol/L H2O2溶液2.0 mL，混勻后靜置10 min[29]；再加入6 mmol/L水楊酸2.0 mL，混勻靜置30 min后于510 nm處測(cè)其吸光度，所得值為Ai；用去離子水代替H2O2時(shí)測(cè)定吸光值為Aj；空白對(duì)照組以2.0 mL蒸餾水代替不同濃度的樣品，測(cè)定其吸光度為A0。每個(gè)濃度提取液平行做3次，結(jié)果取平均值。用以下公式計(jì)算對(duì)·OH的清除率:

清除率 Y =[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

1.3.5.4超氧自由基清除能力的測(cè)定

取50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2)4.5 mL，于25 ℃下預(yù)熱20 min，加入1.0 mL不同濃度的樣品，接著立即加入25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL混勻，25 ℃水浴反應(yīng)30 s后，立即滴加10 mmol/L的鹽酸1.0 mL終止反應(yīng)[30]，于320 nm下測(cè)定吸光度Ai；空白對(duì)照組以1.0 mL蒸餾水代替不同濃度的樣品，測(cè)定其吸光度A0。

清除率=(A0-Ai)/A0×100%。

1.3.6統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)均做了3次平行，結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗(yàn)

圖1　回流溫度對(duì)黃酮含量的影響Fig.1 Effect of the refluxing temperature on the content of total flavonoids

由圖1可知，隨著回流溫度升高，總黃酮含量隨之增加，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，總黃酮含量最高，總黃酮含量達(dá)到21.79 mg/g。溫度過(guò)高，黃酮容易受到高溫破壞，其他雜質(zhì)分子溶出量也相應(yīng)增加，會(huì)給后續(xù)工作帶來(lái)不便[31]。為保證總黃酮能夠被充分提取的同時(shí)防止過(guò)高溫度所引起的黃酮類化合物分解以及溶劑的損失，考慮多種因素的影響，在探討香菜乙醇回流最適合研究試驗(yàn)中選擇最適宜提取溫度在80 ℃范圍內(nèi)。

圖2　回流時(shí)間對(duì)黃酮含量的影響Fig.2 Effect of the refluxing time on the content of total flavonoids

由圖2可知，在60～75 min時(shí)，隨著回流時(shí)間的增加，總黃酮含量增加，在75 min處達(dá)到最大值，此時(shí)總黃酮的含量為15.50 mg/g，而在75～120 min之間，隨著回流時(shí)間的增加，總黃酮含量反而下降，從15.50 mg/g降到14.38 mg/g。加熱回流時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)造成部分黃酮糖苷類的分解，導(dǎo)致總黃酮含量降低[32]。因此，在試驗(yàn)范圍及結(jié)合可實(shí)際操作選擇回流時(shí)間為75 min比較適宜。

圖3　乙醇濃度對(duì)黃酮含量的影響Fig.3 Effect of the ethanol concentration on the content of total flavonoids

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮含量相對(duì)增加，濃度低時(shí)增加得比較慢；濃度高時(shí)增加得比較快。隨著乙醇濃度的增加，其極性變?nèi)?，有利于極性較小的黃酮類化合物的溶出，總的黃酮溶出量增多。因此，選擇無(wú)水乙醇進(jìn)行回流，提取效果比較好。

單因素試驗(yàn)表明回流溫度、回流時(shí)間和乙醇濃度對(duì)乙醇提取香菜黃酮有顯著的影響。隨著回流時(shí)間的增加，黃酮含量先增大后減小，回流時(shí)間為75 min時(shí)黃酮含量最高，因此確定相應(yīng)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)的回流時(shí)間范圍為70～80 min?；亓鳒囟葘?duì)黃酮含量的影響與回流時(shí)間類似，但當(dāng)回流溫度為80 ℃時(shí)，黃酮含量值達(dá)到最大，因此確定相應(yīng)正交優(yōu)化設(shè)計(jì)的回流溫度范圍為75～98 ℃。乙醇添加量為100%時(shí)黃酮含量最高，因此確定乙醇濃度范圍為90%～100%。

2.2　正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度(A)、回流時(shí)間(B)和回流溫度(C)為試驗(yàn)因素，分別選擇3個(gè)水平(見(jiàn)表3)，以黃酮提取率作為檢測(cè)指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experiment

續(xù)　表

由表3正交試驗(yàn)的極差值R可知，3個(gè)因素對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響程度為A>C>B，即乙醇濃度>回流溫度>回流時(shí)間。黃酮提取率結(jié)果表明：9個(gè)樣品中，7號(hào)最高，達(dá)22.3 mg/g，即在98 ℃條件下，用無(wú)水乙醇回流2次，70 min 1次。而正交試驗(yàn)得出的優(yōu)組合是A3B2C2，即在80 ℃條件下，用無(wú)水乙醇回流2次，75 min 1次。將正交試驗(yàn)中黃酮提取率最高的7號(hào)組合與A3B2C2組合進(jìn)行比較，兩者黃酮提取率相差不大，且7號(hào)組合是用98 ℃的高溫回流，所以選擇溫度低的優(yōu)組合為A3B2C2。

2.3　抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.3.1總抗氧化能力

圖4　香菜提取液的總抗氧化能力Fig.4 Total antioxidant capacity of ethanol extract from Coriandrum sativum

由圖4可知，香菜提取液黃酮濃度與總抗氧化能力呈現(xiàn)量效關(guān)系。以總抗氧化能力為Y、黃酮濃度為X，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得回歸方程為：Y=48.24X+23.90，相關(guān)系數(shù)R2=0.9935。隨著黃酮濃度的增加，總抗氧化能力也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到1 g/L時(shí)，總抗氧化能力相當(dāng)于67.81 mg/L的VitC；而質(zhì)量濃度增加到5 g/L時(shí)，則總抗氧化能力相當(dāng)于142.39 mg/L的VitC。

2.3.2還原能力

圖5　香菜提取液的還原能力Fig.5 Reducing power of ethanol extract from Coriandrum sativum

由圖5可知，香菜提取液黃酮濃度與還原能力線性關(guān)系一般。以還原能力為Y、黃酮濃度為X，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得回歸方程為：Y=24.86X-10.47，相關(guān)系數(shù)R2=0.9731。隨著黃酮濃度的增加，還原能力也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到1 g/L時(shí)，還原能力相當(dāng)于21.49 mg/L的VitC；而質(zhì)量濃度增加到5 g/L時(shí)，則還原能力相當(dāng)于121.04 mg/L的VitC。

2.3.3羥基自由基清除能力

根據(jù)羥基清除率公式計(jì)算清除率，香菜提取液黃酮濃度與清除率關(guān)系見(jiàn)圖6。

圖6　香菜提取液的羥基自由基清除能力Fig.6 Scavenging activity of ethanol extract from Coriandrum sativum on ·OH

由圖6可知，隨著黃酮濃度的增加，羥基自由基的清除率也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到2 g/L時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為32.25%；而當(dāng)其質(zhì)量濃度增加到4 g/L時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為45.04%；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到5 g/L時(shí)，則對(duì)羥基自由基的清除率大于50%。以清除率為Y(%)、黃酮濃度為X(g/L)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得回歸方程為：Y=9.34X+9.99，相關(guān)系數(shù)R2=0.9616，IC50=4.28 g/L。

2.3.4超氧自由基清除能力

根據(jù)超氧自由基清除率公式計(jì)算清除率，香菜提取液黃酮濃度與清除率關(guān)系見(jiàn)圖7。

圖7　香菜提取液的超氧自由基清除能力Fig.7 Scavenging activity of ethanol extract from Coriandrum sativum on O2-·

由圖7可知，隨著黃酮濃度的增加，超氧自由基的清除率也隨著增加；當(dāng)黃酮濃度增加到2 g/L時(shí)，對(duì)超氧自由基的清除率為29.56%；當(dāng)質(zhì)量濃度增加到4 g/L時(shí)，則對(duì)超氧自由基的清除率大于50%。以清除率為Y(%)、黃酮濃度為X(g/L)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得回歸方程為：Y=10.30X+7.44，相關(guān)系數(shù)R2=0.9687，IC50=4.13 g/L。

綜上所述，香菜提取液黃酮濃度與其抗氧化活性之間有著顯著的相關(guān)性。隨著黃酮濃度的增加，還原能力越大，抗氧化能力越強(qiáng)；在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，香菜乙醇提取液還原能力和總抗氧化能力呈正相關(guān)；隨著黃酮濃度的增加，羥基自由基和超氧自由基的清除率也隨著增加；當(dāng)香菜提取液黃酮濃度較低(1～2 g/L)時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率強(qiáng)于超氧自由基的清除率；當(dāng)香菜提取液黃酮濃度為3～ 4 g/L時(shí)，對(duì)超氧自由基的清除率強(qiáng)于羥基自由基的清除率；當(dāng)香菜提取液黃酮濃度較高(5 g/L)時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率強(qiáng)于超氧自由基的清除率。

3　結(jié)論與討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定香菜總黃酮的最優(yōu)乙醇回流工藝，無(wú)水乙醇在回流溫度80 ℃條件下回流2次，每次回流時(shí)間75 min，共2次150 min，在此條件下黃酮的提取率為2.24%。肖衛(wèi)華等[33]用90%的乙醇在75 ℃條件下回流150 min，測(cè)得黃芪提取黃酮得率為0.0934%。劉韜等用67%的乙醇，微波溫度80 ℃，從香菜中提取黃酮的得率為1.31%。

本文進(jìn)一步探討香菜乙醇提取液的抗氧化活性。香菜提取液黃酮濃度與其抗氧化活性之間有著顯著的相關(guān)性。隨著黃酮濃度的增加，總抗氧化能力、還原能力、羥基自由基和超氧自由基的清除率也隨著增加。當(dāng)黃酮濃度為5 g/L時(shí)，總抗氧化能力相當(dāng)于142.39 mg/L的VitC，還原能力相當(dāng)于121.04 mg/L的VitC，對(duì)羥基自由基的清除率為59.11%，對(duì)超氧自由基的清除率為55.61%。

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