正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選花椒多酚的超聲波輔助提取工藝

李利華

(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中　723000)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，為蕓香科花椒屬植物，在我國大部分地區(qū)均有種植，其果皮為我國特有的食用香辛調(diào)料和中藥材[1]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為[2]，花椒作為中藥材，具有逐寒、行氣、止痛、殺蟲等功效，可以有效治療胃脘冷痛、嘔吐、腹瀉、蛔蟲等癥，還可用作表皮麻醉劑?，F(xiàn)代研究表明[3]：花椒中含有揮發(fā)油、生物堿、黃酮、多酚以及脂肪酸、酰胺類物質(zhì)等多種活性成分，具有抑菌、鎮(zhèn)痛、麻醉、抗氧化和抗癌等生物活性。目前，有關(guān)花椒中活性成分的研究已有相關(guān)的報(bào)道[4,5]，而關(guān)于花椒提取中多酚類物質(zhì)的研究報(bào)道較少。

植物多酚(plant polyphenol)是一類廣泛存在于植物體的根、木、果、葉、皮中的植物的次生代謝產(chǎn)物，屬于芳香族羥基衍生物[6]。近年來已有研究證實(shí)[7,8]，植物多酚是一種天然的抗氧化劑，能夠有效阻斷人體脂質(zhì)自氧化，清除體內(nèi)過量自由基，延緩機(jī)體衰老等作用，是目前研究的熱點(diǎn)。本研究采用超聲波輔助法提取花椒中的多酚類化合物，先通過考察花椒多酚提取的4個主要影響因素：提取劑(乙醇)濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間對花椒多酚提取率的影響，再采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化花椒多酚的超聲波輔助提取工藝參數(shù)條件，皆在為花椒多酚的開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1　材料與儀器

陜西紅花椒：市售，經(jīng)陜西理工大學(xué)生物系李新生教授鑒定為蕓香科灌木花椒樹的果實(shí)種皮。

沒食子酸、福林-酚；試劑、無水碳酸鈉、雙氧水、石油醚等試劑：均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水：二次蒸餾水。

KQ-700VDE型三頻式超聲波處理器昆山超聲儀器公司；UV型紫外-可見分光光度計(jì)日本島津公司；TD-214型電子分析天平北京梅特勒儀器有限公司；中草藥粉碎機(jī)河北宏博中藥機(jī)械制造有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1花椒多酚提取工藝流程

花椒果皮清洗→低溫烘干至恒質(zhì)量→粉碎→石油醚脫脂、脫色→揮發(fā)盡溶劑→乙醇浸提多酚→真空抽濾→測定提取液吸光度→真空干燥得花椒粗多酚。

1.2.2花椒多酚提取率的測定

采用福林-酚試劑顯色法[9]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對照品，于765 nm處測定吸光度值，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，多酚含量(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.8665C+0.1041，R2=0.9985。

精密吸取1.0 mL花椒多酚提取液于10 mL比色管中，依次加入1.0 mL福林-酚試劑和4 mL 15%Na2CO3溶液，以60%乙醇補(bǔ)足至刻線，室溫避光反應(yīng)2 h，利用紫外-可見分光光度計(jì)在波長765 nm下測定吸光度A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量及提取率，每個樣品做3份重復(fù)。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以花椒多酚提取率為衡量指標(biāo)，恒定超聲波功率280 W，分別考察4個主要因素：乙醇濃度(40%，50%，60%，70%，80%)、料液比(1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)和提取時(shí)間(30，45，60，75，90 min)對花椒中多酚類物質(zhì)提取率的影響，每個處理做3份平行，選取各因素的適宜水平范圍。

1.2.4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表[10]，優(yōu)化花椒多酚的超聲波輔助提取最佳工藝參數(shù)條件，因素水平表見表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.5實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0和SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)并做圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1乙醇濃度對花椒多酚提取效果的影響

圖1　乙醇濃度對提取效果的影響

由圖1可知，乙醇濃度在40%～60%范圍內(nèi)，多酚提取率隨乙醇濃度的增大呈上升趨勢，且在乙醇濃度為60%時(shí)提取率最高，為6.84%；而當(dāng)乙醇濃度高于60%后，多酚提取率有所下降。這可能是濃度為60%的乙醇與花椒多酚的親和能力最強(qiáng)，促使花椒多酚最大限度地溶出。因此，乙醇濃度選擇60%左右為最佳濃度條件。

2.1.2料液比對花椒多酚提取效果的影響

圖2　料液比對提取效果的影響

由圖2可知，在料液比由1∶20增加到1∶30過程中，花椒多酚提取率迅速上升，說明適度增大提取劑的用量有利于原料和提取劑的充分接觸，增加濃度的梯度差，從而提高其提取率；在料液比1∶30～1∶50過程中，花椒多酚提取率變化不大，且在料液比1∶40時(shí)提取率達(dá)最大值6.07%，之后提取率緩慢下降。這可能是多酚溶出已基本飽和，再增大提取劑用量會使其他雜質(zhì)的溶出增多，影響多酚的提取率。因此選擇料液比為1∶40左右。

2.1.3提取溫度對花椒多酚提取效果的影響

圖3　提取溫度對提取效果的影響

由圖3可知，在40～60 ℃范圍內(nèi)，花椒多酚的提取率隨著提取溫度的升高明顯增加，提取溫度為60 ℃時(shí)多酚提取率達(dá)最大值6.80%，之后提取溫度繼續(xù)升高，多酚提取率開始下降，80 ℃時(shí)多酚提取率僅為6.35%。這說明適度升溫加快了分子的擴(kuò)散速度，有利于花椒多酚的浸出；而提取溫度過高一方面會引起乙醇溶劑的揮發(fā)，另一方面高溫會使花椒中雜質(zhì)的溶出量增加，導(dǎo)致花椒多酚提取率下降。因此，選擇提取溫度60 ℃左右。

2.1.4提取時(shí)間對花椒多酚提取效果的影響

圖4　提取時(shí)間對提取效果的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長，花椒多酚的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在提取時(shí)間為60 min時(shí)花椒多酚提取率最高，為6.21%；提取時(shí)間超過60 min，花椒多酚提取率逐漸下降。這說明適當(dāng)延長提取時(shí)間，有利于花椒多酚活性成分在溶劑中的充分?jǐn)U散和溶出，而提取時(shí)間過長，會使溶液中已溶出的多酚物質(zhì)分解，從而導(dǎo)致花椒多酚提取率的下降。因此，選用提取時(shí)間60 min左右。

2.2　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

表2　正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3　方差分析表

由表2可知， A(乙醇濃度)對花椒多酚的提取率影響最大，其次是C(提取溫度)，B(料液比)對花椒多酚提取率影響最小，優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為：A2B2C2D2，即：乙醇濃度60%，料液比1∶40，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min。由表3方差分析可知，4個因素中A(乙醇濃度)對花椒多酚的提取率具有顯著性影響，其他3個因素均無顯著性影響。

2.3　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

因利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的花椒多酚最佳提取工藝條件與表2中的9組實(shí)驗(yàn)不重復(fù)，故通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考察該工藝條件的穩(wěn)定性，在最佳工藝條件下(乙醇濃度60%，料液比1∶40，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min)提取花椒多酚，并測定多酚提取率，制備3份平行試樣，得到花椒多酚平均提取率為(7.05±0.03)%，高于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的9組多酚提取率

數(shù)值，表明該工藝條件比較穩(wěn)定，可以作為花椒多酚超聲波輔助提取的最佳工藝條件。

3　結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對花椒的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乙醇濃度對花椒多酚的提取達(dá)到顯著性水平，優(yōu)化得到的最佳工藝條件為乙醇濃度60%，料液比1∶40，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在優(yōu)化得到的最佳工藝條件下，花椒多酚提取率為(7.05±0.03)%，高于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的數(shù)值，表明該工藝條件穩(wěn)定，可以作為花椒多酚的超聲波輔助提取工藝條件，為花椒多酚的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)參考，為花椒資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃成就.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1997:8.

[2]張衛(wèi)明,肖正春.中國辛香料植物資源開發(fā)利用[M].南京:東南大學(xué)出版社,2007:640.

[3]趙秀玲.花椒的化學(xué)成分、藥理作用及其資源開發(fā)的研究進(jìn)展[J].中國調(diào)味品,2012,37(3):1-5.

[4]郭靜.花椒中有效成分的分析測定方法和抗氧化作用研究[D].重慶:西南大學(xué),2008.

[5]Negi1 J S,Bisht V K,Bhandari A K,et al.Chemical constituents and biological activities of the genusZanthoxylum: a review[J].Afr J Pure Appl Chem,2011,5(12):412-416.

[6]石碧,狄瑩.植物多酚[M].北京:科學(xué)出版社,2000:19-20.

[7]趙偉,李建科,何曉葉,等.幾種常見植物多酚降血脂作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2014,35(21):258-263.

[8]Irina V,Ioana I,Mariana N,et al.Thermal stability,antioxidant activity,and photo-oxidation of natural polyphenols[J].Chemical Papers,2017,68(1):121-129.

[9]李利華.魚腥草多酚的超聲波輔助提取及抗氧化性能研究[J].食品工業(yè)科技,2016,37(3):112-116.

[10]何為,薛衛(wèi)東.優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):方法及數(shù)據(jù)分析[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2014:6-12.