循環(huán)纖維細胞在慢性哮喘模型小鼠氣道重塑中的作用

任冬花　關　巍　馮喜英　李西玲　趙　立

(西寧市第二人民醫(yī)院呼吸科,青?！∥鲗帯?10003)

1青海大學附屬醫(yī)院呼吸科

2中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院第一呼吸與重癥監(jiān)護內科病房

哮喘以氣道高反應性、可逆性氣流受限和慢性氣道炎癥為特點〔1〕循環(huán)纖維細胞隨著其來源、表型轉化的特點和在組織損傷修復過程中的作用得到認可，學者們對其研究越來越多〔2～4〕。本文探討循環(huán)纖維細胞在哮喘氣道重塑中的作用。

1　材料與方法

1.1材料SPF級健康雌性BALB/c 小鼠30 只，6 周齡，體重(20±3)g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供(合格證編號4200592945)。將其隨機編號并分為：對照組、哮喘組和氯化釓清空組，每組10只。室內溫度18℃～25℃，濕度45%～55%，飼料和應用水均經(jīng)充分消毒，保證充足食物和水分供應。每日觀察小鼠生存狀態(tài)，及時更換敷料和鼠籠，保證其生存環(huán)境衛(wèi)生。卵原蛋白(OVA)、氯化釓、戊巴比妥鈉：美國Sigma 公司；氫氧化鋁：上海金賽醫(yī)藥化工有限公司；大鼠抗小鼠CD45 單克隆抗體：美國Biolegend 公司；免疫酶標雙標試劑盒購：福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；多聚賴氨酸：金賽醫(yī)藥化工有限公司；兔抗小鼠Ⅰ型膠原單克隆抗體、兔抗小鼠α-平滑肌肌動蛋白(SMA)單克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法第1、8、15天哮喘組和氯化釓清空組小鼠腹腔內注射氫氧化鋁(2 mg)和OVA(20 μg)混懸液，對照組以等量磷酸鹽緩沖液(PBS)代替。第21天開始，哮喘組和氯化釓清空組給予50 mg/kg 戊巴比妥麻醉后，經(jīng)滴鼻吸入0.2%OVA激發(fā)小鼠，50 μl/只，每周3次，持續(xù)至第52天，共計13次，對照組等量PBS 等時間間隔滴鼻吸入。每次激發(fā)前10 min，氯化釓清空組經(jīng)尾靜脈給予氯化釓(2 mg/ml，10 mg/kg，每隔2 d 1次)，對照組和哮喘組用等量的PBS代替，給予時間和方式與氯化釓清空組相同。通過HE染色觀察組織形態(tài)學變化及圖像分析；通過Masson染色觀察膠原沉積；通過免疫酶標雙標染色法觀察氣道纖維細胞表面表達。

1.3主要觀察指標HE染色觀察組織形態(tài)學變化及圖像分析 將肺組織標本切片置于光學顯微鏡下，先于100倍下找到視野，后放大到400倍下仔細觀察各組小鼠支氣管肺組織的基底膜、平滑肌厚度變化及嗜酸性粒細胞浸潤和上皮細胞、杯狀細胞的改變情況。并在400倍下找到完整的支氣管橫斷面，用HIMAS-2000圖像分析軟件測量支氣管基底膜周徑(Pbm)、基底膜面積(Bm)和平滑肌面積(Wam)。Masson 染色觀察膠原沉積：光學顯微鏡下觀察并比較各組切片組織中膠原變化情況。參照文獻〔5〕，以固定顏色模式界定膠原，色調、飽和度、顏色強度等條件下測定氣道壁膠原面積(WAc)，結果以單位長度基底膜的膠原面積(WAc/Pbm，μm2/μm)表示。免疫酶標雙標染色法觀察氣道纖維細胞表面表達：將Ⅰ型膠原和α-SMA表達陽性的細胞質經(jīng)即用型堿性磷酸酶染色液(BCIP/NBT)染色(陽性顯色為藍黑色)，CD45表達陽性的細胞質經(jīng)AEC 染色(陽性染色為紅色)。染色后的組織切片置于光學顯微鏡下，先于低倍鏡下找到視野，放大到高倍鏡后，觀察比較CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達狀況。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、t檢驗，兩個變量間的關系采用線性相關分析。

2　結　果

2.1各組小鼠一般情況表現(xiàn)哮喘組小鼠經(jīng)致敏和激發(fā)兩階段后，出現(xiàn)了不同程度的煩躁不安、易激惹、呼吸急促、喘息等癥狀；對照組小鼠行動敏捷，未見異常；氯化釓清空組上述表現(xiàn)較哮喘組明顯減輕。

2.2各組支氣管肺組織病理改變及形態(tài)學觀察見圖1 和表1，哮喘組基底膜、平滑肌層厚度較對照組顯著增厚(P<0.05)，氯化釓清空組較哮喘組基底膜、平滑肌厚度顯著降低(P<0.05)。

圖1　各組肺組織病理學變化(HE，×400)

組別基底膜厚度平滑肌厚度對照組219±0391)617±0691)哮喘組890±0532305±074氯化釓清空組372±0321)886±0541)P值001001

與哮喘組比較：1)P<0.05

2.3各組氣道膠原沉積狀況見圖2，表2，各組Masson染色的結果顯示，對照組氣道和血管周圍少量的膠原沉積或不表達；哮喘組可見氣道和血管周圍大量的膠原沉積，其中以氣道的基底膜為主，肺泡間隔也可見膠原沉積，較對照組明顯增多；氯化釓清空組可見氣道和血管周圍有膠原沉積，肺泡間隔也可見膠原沉積均較對照組增多；但氯化釓清空組的膠原表達量均比哮喘組減少。HIMAS-2000 圖像分析結果顯示：與對照組〔(6.03±0.17)μm2/μm〕比較，哮喘組〔(31.74±2.08)μm2/μm〕和氯化釓清空組〔(16.02±0.92)μm2/μm〕的膠原表達量明顯增加(均P<0.05)；氯化釓清空組的膠原表達量較哮喘組減少，但仍多于對照組(均P<0.05)。

圖2　各組肺組織膠原沉積(Masson,×400)

2.4各組氣道CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達見圖3和圖4，與對照組氣道CD45、Ⅰ型膠原和α-SMA的表達相比，哮喘組和氯化釓清空組的表達明顯增加(P<0.01)；其中哮喘組比氯化釓清空組表達增加(均P<0.05)，見表2。

圖3　各組氣道CD45 和Ⅰ型膠原表達(免疫組化，×400)

圖4　各組氣道CD45和α-SMA表達(免疫組化，×400)

組別CD45+Ⅰ型膠原CD45+α?SMA對照組01372±0033501177±00171哮喘組02290±003221)02273±002361)氯化釓清空組01498±002131)2)01366±001501)2)

與對照組比較：1)P<0.01;與哮喘組比較：2)P<0.05

2.5小鼠氣道CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原表達水平與基底膜厚度的相關性哮喘組氣道組織CD45和Ⅰ型膠原表達與基底膜厚度呈正相關(r=0.86，P<0.01)；CD45和α-SMA表達呈正相關(r=0.95，P<0.01)。氯化釓清空組氣道組織CD45和Ⅰ型膠原表達與基底膜厚度呈相關(r=0.96，P<0.01)，氯化釓清空組氣道組織CD45和α-SMA表達與基底膜厚度呈正相關(r=0.89，P<0.01)。

3　討　論

氣道重塑的發(fā)生機制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者支氣管上皮下纖維細胞數(shù)量較正常人增多，并與支氣管基底膜的增厚相關〔6，7〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠氣道CD45高水平表達，表明氣道表達CD45 的細胞可能來源于循環(huán)纖維細胞。同樣，哮喘小鼠氣道Ⅰ型膠原的表達增高和氣道中膠原沉積量顯著增加，這一方面說明膠原的沉積在氣道重塑中起著至關重要的作用；另一方面表明纖維細胞具有相當活躍的生成膠原的能力，提示慢性哮喘氣道重塑可能與氣道纖維細胞水平有關，與Nihlberg等〔8〕的實驗結果一致，相比正常受試者，輕度哮喘患者支氣管黏膜及肺泡灌洗液中共同表達CD45、Ⅰ型膠原和α-SMA 的纖維細胞數(shù)量增加，這些細胞多聚集在鄰近基底膜部位，且黏膜下纖維細胞的數(shù)量與基底膜的厚度呈正相關。

氯化釓是循環(huán)纖維細胞前體即單核細胞的特異性抑制劑，通過特異性誘導外周血單核細胞的凋亡來特異性抑制其分化〔9,10〕。本實驗結果表明運用氯化釓清空循環(huán)纖維細胞后，氣道重塑得到顯著抑制，提示循環(huán)纖維細胞在慢性哮喘氣道重塑中起著重要的作用〔11,12〕。

然而，本次實驗并未提供直接的證據(jù)表明，哮喘小鼠支氣管黏膜中的纖維細胞是從循環(huán)中招募而來的纖維細胞，即氣道中的纖維細胞也有可能是來自于氣道中固有的未經(jīng)確認的前體細胞。在分化過程中是否存在中間過渡的細胞亞型如前肌成纖維細胞；循環(huán)纖維細胞是直接分化為肌成纖維細胞，還是它刺激了組織中固有間質細胞或者其他前體細胞的增殖分化，這些仍需進一步研究。

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