低頻電針對(duì)阿爾茨海默病大鼠炎癥因子表達(dá)的影響

王錫麟　劉若蘭　沈　沉　周　華　孫國(guó)杰　沈　峰

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北　武漢　430000)

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院2湖北省中醫(yī)院

炎癥在阿爾茨海默病(AD)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要地位已被基礎(chǔ)研究證實(shí)〔1〕。作為AD病理過(guò)程的最初事件，β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積誘發(fā)包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子激活在內(nèi)的一系列炎癥反應(yīng)，促使神經(jīng)細(xì)胞死亡或加速死亡，引起一系列臨床癥狀，是AD發(fā)病過(guò)程中重要的病理機(jī)制〔2〕。本研究觀察低頻電針對(duì)AD模型大鼠炎癥相關(guān)因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α的影響，以期探討電針對(duì)抗AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的炎癥機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物分組雄性SPF級(jí)Wistar大鼠30只，鼠齡(12±2)月齡，體重(360±20)g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005。購(gòu)入后分籠飼養(yǎng)于安靜、清潔的環(huán)境下，相對(duì)濕度為60%，相對(duì)溫度控制在(22±2)℃，按時(shí)給以飲水和飼料。常規(guī)喂養(yǎng)1 w后，大鼠無(wú)任何不良反應(yīng)，即行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，剔除反應(yīng)過(guò)于敏感或遲鈍的大鼠。隨機(jī)選取30只大鼠分為假手術(shù)組、模型組和電針組各10只。

1.2主要儀器和主要試劑主要儀器：腦立體定位儀(編號(hào)89-00136，西安西北光電儀器廠)，牙科鉆(成都康發(fā)醫(yī)療器械有限公司)，韓式疼痛治療儀(型號(hào)HANS-100A，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)，GC-1200γ放免計(jì)數(shù)器(中國(guó)科技大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司)，日產(chǎn)Olympus BX50光學(xué)顯微鏡，HPIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限責(zé)任公司)，Aβ25～35(美國(guó)Sigma公司)，IL-1β、TNF-α抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，免疫組化(SP)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，125I-IL-1β、TNF-α試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)20120420)。

1.3造模方法凝聚態(tài)Aβ25～35的孵育：將0.1 mg的Aβ25～35用二甲基亞砜50 μl溶解，再用0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)50 μl稀釋配制成濃度為10 μg/μl的溶液，密封后置于37℃溫箱孵育1 w，觀察其出現(xiàn)明顯的絮狀形態(tài)，表明此時(shí)的Aβ25～35為凝聚態(tài)，孵育完成，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。AD模型采用雙側(cè)海馬一次性注射聚集態(tài)Aβ25～35的方法制備。Wistar大鼠稱重，腹腔注射10%的水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，頭頂部常規(guī)備皮，消毒并剪開(kāi)頭皮，分離皮下組織，暴露顱骨找到前囟位置，再將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，固定時(shí)注意保持大鼠前后囟在同一水平。定位海馬區(qū)(前囟后3.5 mm，左右旁開(kāi)2 mm，腦膜表面下2.7 mm)用牙科鉆鉆孔穿顱，將1 μl的微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針到達(dá)海馬區(qū)，左右兩側(cè)各緩慢注入凝聚態(tài)的Aβ25～35，每側(cè)10 μg，注射速度控制在0.2 μl/min，完畢后留針5 min后緩慢出針，以使Aβ25～35充分浸潤(rùn)局部組織。術(shù)后常規(guī)縫合2～3針，碘伏外擦消毒以預(yù)防感染。

1.4干預(yù)方法 造模后第7天開(kāi)始，電針組定取腎俞穴(第二腰椎下兩旁)、大椎穴(第七頸椎與第一胸椎間，背部正中)、內(nèi)關(guān)穴(前肢內(nèi)側(cè)，離腕關(guān)節(jié)約3 mm，左右的尺橈骨縫間)，使用28號(hào)1寸華佗牌無(wú)菌毫針，腎俞穴直刺5 mm、大椎穴斜刺5 mm、內(nèi)關(guān)穴斜刺3 mm，同側(cè)腎俞穴、內(nèi)關(guān)穴接韓式電針儀，強(qiáng)度為1 mA，選擇2 Hz連續(xù)波，通電治療20 min，每周連續(xù)治療6次，6 d為1個(gè)療程，療程間隔1 d，共治療2個(gè)療程。模型組同電針組，每次進(jìn)行抓取固定等刺激。假手術(shù)組同模型組，注射等量的生理鹽水，其余操作同模型組。

1.5血清IL-1β、TNF-α的檢測(cè)完成行為學(xué)檢測(cè)后第2天，大鼠眼球常規(guī)取血，分離血清，離心取上清液-20℃保存。放射免疫法檢測(cè)大鼠血清IL-1β、TNF-α。按照試劑盒步驟，γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定血清沉淀的每分放射性脈沖數(shù)(cpm)。根據(jù)IL-1β、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，測(cè)算出樣品的比放射性，求出相應(yīng)樣品的IL-1β、TNF-α濃度。

1.6海馬IL-1β、TNF-α的檢測(cè)大鼠取血后，脫頸處死，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片。采用SP法檢測(cè)海馬IL-1β、TNF-α的表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Olympus BX50光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞并攝像。于物鏡40倍下，每張切片選取相鄰3個(gè)視野，用HPIAS-2000型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)IL-1β、TNF-α陽(yáng)性染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析，測(cè)定其灰度值，計(jì)算每組標(biāo)本的平均灰度值。平均灰度值越小，說(shuō)明相應(yīng)蛋白表達(dá)越強(qiáng)。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)　果

2.1各組血清IL-1β、TNF-α的表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組血清IL-1β、TNF-α明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，電針組血清IL-1β、TNF-α含量顯著減少(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　各組血清IL-1β、TNF-α水平比較

與模型組比較:1)P<0.01；與假手術(shù)組比較:2)P<0.01

2.2各組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白的表達(dá)各組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白均有陽(yáng)性表達(dá)，胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色深染。與假手術(shù)組相比，模型組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，電針組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α蛋白顯著減少(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　各組海馬CA1區(qū)IL-1β、TNF-α表達(dá)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

3　討　論

AD主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退和智力下降，以腦組織萎縮、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)和老年斑(SP)為主要病理改變。其中，Aβ在腦內(nèi)沉積形成SP是AD的發(fā)病基礎(chǔ)。研究〔3〕證實(shí)，在Aβ異常沉積形成SP的周圍，不但有神經(jīng)退行性病變，同時(shí)還存在著膠質(zhì)細(xì)胞(包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)的活化，表明AD過(guò)程中腦內(nèi)出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)過(guò)程。異常沉積的Aβ被認(rèn)為是引起炎癥免疫反應(yīng)的誘發(fā)和激發(fā)因子〔4〕。目前認(rèn)為，Aβ刺激小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)產(chǎn)生的慢性炎癥反應(yīng)〔5〕，導(dǎo)致的凋亡是腦神經(jīng)元缺失的重要機(jī)制，與AD的發(fā)病密切相關(guān)。流行病學(xué)的資料〔6〕研究表明，臨床上使用的非甾體類抗感染藥物可以降低AD發(fā)病率。研究〔7,8〕提示，包括TNF-α、IL-1、IL-6等因子在內(nèi)的炎性介質(zhì)與AD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

IL-1不僅參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，也直接參與炎癥過(guò)程，具有廣泛的生物學(xué)功能〔9〕。在AD中，IL-1β過(guò)度表達(dá)促進(jìn)Aβ的進(jìn)一步沉積，加速AD的不斷惡化〔10〕。IL-1β中存在兩個(gè)可變位點(diǎn)：-551和+3953。IL-1β(-551)T/T基因型和遲發(fā)性AD的提早發(fā)病有關(guān)，且可以增加血漿中IL-1β的表達(dá)〔11〕。IL-1β(+3953)T/T型能提高遲發(fā)性AD的發(fā)病率〔12〕。因此，IL-1被認(rèn)為是AD潛在的炎癥標(biāo)記物〔13〕。

TNF-α可以誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生(如IL-1等)，并協(xié)同IL-1 強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL-6 產(chǎn)生，使淀粉樣前體蛋白(APP)增加，Aβ 沉積。臨床資料〔14〕表明，在AD患者的外周血和腦脊液中，TNF-α的表達(dá)量異常升高，說(shuō)明其過(guò)表達(dá)與AD關(guān)系密切。方芳等〔15〕研究也表明，炎癥反應(yīng)參與了認(rèn)知功能的損害，并認(rèn)為通過(guò)對(duì)炎癥因子的檢測(cè)有助于癡呆患者的早期診斷和治療。系列AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，TNF-α過(guò)度表達(dá)能加重Aβ沉積，引起慢性炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變和行為的異?！?6〕。

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