葡萄籽原花青素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠左室重塑和氧化應(yīng)激的影響

張先杰　王曉玲　黃霜枝　靳俊峰　吳秀香

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，廣東　珠?！?19090)

1遵義市綏陽(yáng)縣人民醫(yī)院心內(nèi)科

目前臨床使用的降壓藥物作用單一，且均有一定的副作用，因此，尋找副作用少、能作用于高血壓發(fā)病的多個(gè)環(huán)節(jié)，并能改善甚至逆轉(zhuǎn)臟器損傷，特別是左室重塑的理想藥物頗為重要。研究發(fā)現(xiàn)，壓力負(fù)荷和氧化應(yīng)激與高血壓左室重塑發(fā)生關(guān)系密切〔1〕，而前期研究表明，葡萄籽原花青素(GSP)具有抗氧化、降壓等作用〔2,3〕，因此推測(cè)GSP對(duì)左室重塑應(yīng)具有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓引起的左室重塑為模型，觀察GSP對(duì)高血壓左室重塑的抑制作用并從氧化應(yīng)激方面探討其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料SPF級(jí)雄性8 周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)24 只，同周齡WKY大鼠6 只，體質(zhì)量(200 ± 20)g，均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。GSP(天津尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司惠贈(zèng)，純度≥95%)；卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司)；p47phox(Santa Cruz公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(Abcam公司)；血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及羥自由基(OH·)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組與給藥24 只SHR隨機(jī)分為4組：SHR組、GSP低和高劑量組及卡托普利組，每組6 只；6 只WKY大鼠為對(duì)照組。治療組大鼠每日灌胃給藥1 次，分別為：GSP 50 mg·kg-1·d-1和200 mg·kg-1·d-1；卡托普利 30 mg·kg-1·d-1；對(duì)照組及SHR組給予等量蒸餾水灌胃。每次灌胃量2 ml，連續(xù)灌胃8 w。

1.2.2大鼠尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)測(cè)定采用Tail-cuff測(cè)壓法，用大鼠無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈壓測(cè)定裝置、多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6420，成都儀器廠)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，每周測(cè)壓1次。

1.2.3全心指數(shù)和心室指數(shù)測(cè)定灌胃治療8 w后，稱(chēng)量大鼠體重，6%水合氯醛(0.5 ml/kg)麻醉大鼠，開(kāi)胸且迅速摘取心臟，于預(yù)冷的生理鹽水(4℃)中沖洗，濾紙吸干，稱(chēng)重。于4℃下去除左右心房、右心室和大血管等組織，保留完整的左心室(包括室間隔)，濾紙吸干后稱(chēng)量其質(zhì)量，分別計(jì)算全心質(zhì)量指數(shù)(HW/BW)和左室質(zhì)量指數(shù)(LVW/BW)。

1.2.4病理學(xué)指標(biāo)觀察在心臟左室中部沿橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織，4%多聚甲醛溶液中固定，行HE染色和Masson染色，顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、大小及心肌間質(zhì)膠原分布情況并使用Digilab2-s軟件拍照(×400)，每個(gè)切片中隨機(jī)選取80個(gè)左心室心肌細(xì)胞橫切面，應(yīng)用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測(cè)量其橫截面積，取平均值作為該大鼠的心肌細(xì)胞橫截面積(CSA)。同樣方法測(cè)量并計(jì)算心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，CVF=心肌間質(zhì)膠原面積/所測(cè)視野面積。

1.2.5心肌組織中SOD、MDA和抑制OH·能力的測(cè)定將凍存大鼠心肌組織制成10%的組織勻漿液，4℃、12 000 r/min離心5 min后取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.6總蛋白的提取和Western印跡檢測(cè)p47phox蛋白表達(dá)大鼠左室心肌制成10%組織勻漿液，加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定樣品的蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，封閉、洗膜后與其特定的稀釋過(guò)的一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加二抗37℃搖床孵育45 min，洗膜，顯色，壓片、曝光、顯影、定影于膠片。膠片拍照后，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以實(shí)驗(yàn)各組吸光蛋白條帶平均值與同一樣品中內(nèi)參條帶的平均值比值作為蛋白的相對(duì)含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1GSP對(duì)SHR SBP的影響灌胃治療8 w后，與對(duì)照組相比，SHR組大鼠尾動(dòng)脈SBP升高顯著(P<0.01)；與SHR組相比，3個(gè)治療組大鼠尾動(dòng)脈SBP均明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2GSP對(duì)SHR HW/BW和LVW/BW的影響經(jīng)灌胃給藥8 w后，與對(duì)照組相比，SHR組大鼠的HW/BW和LVW/BW明顯升高(P<0.01)。與SHR組相比，3個(gè)治療組均使上述指標(biāo)降低，以GSP高劑量組和卡托普利組效果明顯(P<0.01)，且二組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.3GSP對(duì)SHR心肌細(xì)胞形態(tài)和CSA的影響SHR組心肌細(xì)胞肥大，胞質(zhì)腫脹，心肌細(xì)胞間質(zhì)增多，CSA明顯增大，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3個(gè)治療組大鼠的上述情況均有所減輕，以GSP高劑量組和卡托普利組效果顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖1和表2。

表1　GSP對(duì)SHR尾動(dòng)脈SBP、HW/BW和LVW/BW的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.01；與SHR組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

圖1　各組心肌細(xì)胞形態(tài)變化(HE，×400)

組別CSA(μm2)CVF(%)對(duì)照組45398±1817270±022SHR組69892±17171)469±0291)GSP低劑量組67732±16422)436±0272)GSP高劑量組46084±17463)317±0263)卡托普利組45815±17553)295±0223)

2.4GSP對(duì)SHR心肌膠原纖維分布和CVF的影響Masson染色將心肌膠原纖維染成藍(lán)色。對(duì)照組大鼠心肌肌間隙較窄，心肌細(xì)胞之間可見(jiàn)少量膠原纖維。SHR組大鼠心肌肌間隙明顯增寬，肌間隙膠原纖維顯著增多，呈柵欄樣排列。3個(gè)治療組的肌間隙膠原積聚均有所減少，排列較規(guī)則。其中，以GSP高劑量組效果較為顯著，見(jiàn)圖2和表2。

圖2　各組心肌間質(zhì)膠原纖維變化(Masson染色，×400)

2.5GSP對(duì)SHR心肌組織MDA含量、SOD活性和抑制OH·能力的影響給藥8 w后，SHR組心肌組織MDA含量增高顯著(P<0.01)，而SOD活力和抑制OH·能力顯著降低(P<0.01)；3個(gè)治療組心肌組織MDA含量均降低，SOD活力以及抑制OH·能力均升高，以GSP高劑量組和卡托普利組效果顯著(P<0.01)，且二者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3　GSP對(duì)SHR心肌組織中MDA含量、SOD活性和抑制OH·能力的影響

2.6GSP對(duì)SHR心肌組織p47phox蛋白表達(dá)的影響SHR心肌組織p47phox蛋白表達(dá)(1.75±0.07)較對(duì)照組明顯增多(0.96±0.08，P<0.01)，與SHR組相比，GSP低、高劑量組和夫托普利組心肌組織p47phox蛋白表達(dá)均顯著降低(1.52±0.06，1.16±0.07，1.09±0.08)，以GSP高劑量組和卡托普利組降低顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

1：對(duì)照組；2：SHR組；3：GSP低劑量組；4：GSP高劑量組；5：卡托普利組圖3　各組心肌組織p47phox蛋白表達(dá)

3　討　論

長(zhǎng)期高血壓會(huì)導(dǎo)致左室重塑，變化主要包括左室肥大與心肌間質(zhì)纖維化，前者主要表現(xiàn)為左室心肌細(xì)胞體積變大，重量增加，后者主要表現(xiàn)為間質(zhì)中膠原纖維積聚增多〔1〕。本研究結(jié)果表明SHR左室發(fā)生了重塑，模型成功建立，GSP具有緩解SHR左室重塑作用。研究證實(shí)，持續(xù)的壓力負(fù)荷增大即機(jī)械因素是導(dǎo)致左室重塑的原因之一〔4,5〕，其機(jī)制是通過(guò)離子通道和細(xì)胞形變轉(zhuǎn)導(dǎo)等機(jī)制啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道誘發(fā)核內(nèi)基因的重排和活化，導(dǎo)致心肌蛋白合成增加，使心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化，即發(fā)生左室重塑〔1〕。因此，可通

過(guò)降低血管壓力而減輕壓力負(fù)荷，從而緩解左室重塑。關(guān)于GSP的降壓作用，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，意大利學(xué)者報(bào)道〔6〕，GSP能使輕度高血壓患者血壓顯著降低，對(duì)心血管疾病有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSP能使SHR尾動(dòng)脈尤以高劑量GSP治療組效果顯著，與我們先前的研究結(jié)果一致〔2,3〕，表明GSP可以通過(guò)降壓而減輕壓力負(fù)荷來(lái)緩解高血壓的左室重塑。氧化應(yīng)激在引起左室重塑的多種病因中發(fā)揮重要作用〔7〕。氧化應(yīng)激是持續(xù)的高濃度的自由基(主要包括活性氧等)與抗氧化系統(tǒng)失衡所致。NADPH 氧化酶是細(xì)胞內(nèi)活性氧最主要來(lái)源〔8〕，p47phox是此酶的4個(gè)亞單位之一，在心肌細(xì)胞表達(dá)。有學(xué)者在壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大和心力衰竭的豚鼠模型上發(fā)現(xiàn)p47phox轉(zhuǎn)位于心肌細(xì)胞膜增多，其依賴(lài)性的活性氧產(chǎn)生顯著增加〔9〕。活性氧通過(guò)刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1分泌和心肌纖維母細(xì)胞增殖及膠原合成，最終導(dǎo)致左室重塑〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSP可通過(guò)對(duì)抗自由基的生成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力而發(fā)揮降壓及緩解高血壓左室重塑的作用。

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