發(fā)熱伴血小板減少綜合征實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用評(píng)價(jià)研究

姜曉林　張曉梅　逄博　孫大鵬　王顯軍　丁淑軍

250014 濟(jì)南，山東省疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是由我國(guó)發(fā)現(xiàn)的一種新型布尼亞病毒引起的疾病，以發(fā)熱、乏力等全身反應(yīng)和胃腸道癥狀為主并伴有白細(xì)胞和血小板減少[1]，由于該病病死率較高且早期臨床特征不典型，因此選擇使用適宜的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)對(duì)于該病的診斷非常重要。2016年8月在匈牙利布達(dá)佩斯國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)將該病毒分類進(jìn)行調(diào)整，目前該病毒屬于Bunyavirales目，Phenuiviridae科，Phlebovirus屬，命名為SFTSPhlebovirus，該病毒基因組為分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒，包含3個(gè)片段，L片段全長(zhǎng)為6 368個(gè)核苷酸，包含單一讀碼框架，編碼RNA依賴的RNA聚合酶；M片段全長(zhǎng)為3 378個(gè)核苷酸，含有單一的讀碼框架，編碼1 073個(gè)氨基酸的糖蛋白前體；S片段是一個(gè)雙義RNA，基因組以雙向的方式編碼病毒核蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。目前已建立針對(duì)病毒基因組的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)[1-5]和檢測(cè)病毒特異性總抗體、IgM抗體、IgG抗體的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[6-9]，但是不同檢測(cè)方法的適用性以及人類感染后體內(nèi)病毒血癥及抗體動(dòng)態(tài)變化特征的研究較少，本文通過比較各種檢測(cè)技術(shù)對(duì)不同時(shí)期采集標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，并觀察病毒核酸、IgM抗體、IgG抗體的動(dòng)態(tài)特征，為疾病的診斷方法選擇提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1調(diào)查對(duì)象對(duì)各地市報(bào)告的SFTS疑似病例開展個(gè)案調(diào)查，并采集血清標(biāo)本。對(duì)確診病例跟蹤隨訪，采集恢復(fù)期血清標(biāo)本，詳細(xì)記錄標(biāo)本的基本信息。疑似病例定義：具有流行病學(xué)史(近2周有戶外工作、野外旅游或蜱蟲接觸史)且出現(xiàn)發(fā)熱伴外周血血小板和/或白細(xì)胞降低等臨床癥狀者。實(shí)驗(yàn)室診斷病例：滿足疑似病例條件，且病毒核酸或抗體檢測(cè)陽(yáng)性者。血清標(biāo)本保存于-80 ℃冰箱統(tǒng)一檢測(cè)。

1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用三通道探針法檢測(cè)疑似病例血清中病毒核酸，核酸提取采用RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen，德國(guó)，Cat.no.74104)，操作按說明書進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)采用SuperScriptⅢ Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System試劑盒(Invitrogen，美國(guó)，Cat.no.11732)，反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物探針由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供。陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：3個(gè)信道中至少有兩個(gè)信道的CT值< 35即為陽(yáng)性。

1.3捕獲法檢測(cè)病毒IgM抗體(Mac-ELISA)用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液(PH9.6)稀釋抗原(μ鏈抗體，Sigma，美國(guó))濃度至2 μg/ml,每孔加入100 μl，4℃放置過夜，用PBST緩沖液(PH7.4磷酸鹽緩沖液，0.5%吐溫-20)洗板兩次，用含1%BSA的PBST緩沖液，室溫封閉2 h，晾干后真空封板4 ℃保存?zhèn)溆?。包被板中加?00 μl樣品稀釋液(5%脫脂奶粉)，然后加入10 μl待測(cè)血清，每板設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、空白孔各兩孔，37 ℃溫育30 min，PBST洗滌5次，然后每孔加入100 μl核蛋白酶標(biāo)試劑(1∶6000稀釋，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所出血熱室提供)，37 ℃溫育30 min，洗滌5次，扣干，每孔加入酶底物和顯色液各50 μl/孔，室溫顯色10 min，后加入2 mol/L硫酸終止液50 μl/孔。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)A值。陽(yáng)性判定：樣品A值≥臨界值判定為陽(yáng)性；陰性判定：樣品A值<臨界值判定為陰性；臨界值=0.10+陰性對(duì)照孔的平均值(陰性對(duì)照孔A值不足0.02按0.02計(jì)算)。

1.4間接法檢測(cè)病毒IgG抗體基本操作同IgM抗體檢測(cè)，包被抗原采用重組核蛋白(NP，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所出血熱室提供)，包被濃度為2 μg/ml，酶標(biāo)抗體采用辣根過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(1∶2000稀釋，Sigma，美國(guó))，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)A值。陽(yáng)性判定：樣品A值≥臨界值判定為陽(yáng)性；陰性判定：樣品A值<臨界值判定為陰性；臨界值=0.10+陰性對(duì)照孔的平均值(陰性對(duì)照孔A值不足0.04按0.04計(jì)算)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法按照發(fā)病到采樣的時(shí)間間隔分組，比較不同檢測(cè)方法對(duì)不同時(shí)間組采集標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，分析檢測(cè)結(jié)果與采樣時(shí)間的關(guān)系。抗體動(dòng)態(tài)特征分析以檢測(cè)OD值作為觀察指標(biāo)，為便于觀察將標(biāo)本檢測(cè)OD值/0.05后，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定性資料采用R*C列表卡方檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1疑似病例血標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果分析SFTS疑似患者血清87份，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)核酸陽(yáng)性46份，陽(yáng)性率為53.41%。IgM抗體陽(yáng)性27份，陽(yáng)性率為31.03%, IgG抗體陽(yáng)性3份，陽(yáng)性率為3.41%。病毒核酸或抗體檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本合計(jì)55份，其中病毒核酸和IgM抗體均為陽(yáng)性19份，病毒核酸和IgM抗體均陰性血清1份，兩種方法檢測(cè)的一致率為36.36%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.82，P=0.009)，kappa值=-0.257,一致性較低，詳見表1。

表1　發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒核酸與IgM抗體檢測(cè)結(jié)果比較

55份實(shí)驗(yàn)室診斷病例，核酸檢測(cè)發(fā)現(xiàn)7～9 d采集標(biāo)本陽(yáng)性率最高，12 d后采集標(biāo)本核酸檢測(cè)為陰性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同時(shí)間采集標(biāo)本，核酸檢測(cè)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.35，P=0.016)，詳見表2。

表2　發(fā)熱伴血小板減少綜合征確診病例血標(biāo)本病毒核酸檢出情況與采樣時(shí)間間隔相關(guān)性分析

2.2雙份血標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果比較對(duì)其中34例病毒核酸陽(yáng)性病例進(jìn)行隨訪，采集恢復(fù)期血清，核酸檢測(cè)均為陰性。IgM抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)8例，占23.53%(8/34), IgM抗體轉(zhuǎn)陰8例，占23.53%(8/34)，IgG抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)32例，占94.12%(32/34)。與急性期(38.23%)比較，恢復(fù)期IgM抗體陽(yáng)性14份，陽(yáng)性率為41.18%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)，詳見表3。IgG抗體陽(yáng)性32份，陽(yáng)性率為94.12%，明顯高于急性期IgG抗體陽(yáng)性率(0%)。

圖1　發(fā)熱伴血小板減少綜合征抗體動(dòng)態(tài)特征及抗體陽(yáng)性檢出情況Fig.1　The trend of antibody titer and positive rates of IgM and IgG antibodies of SFTSV

IgM抗體恢復(fù)期IgM抗體陽(yáng)性恢復(fù)期IgM抗體陰性急性期IgM抗體陽(yáng)性58急性期IgM抗體陰性912

注：統(tǒng)計(jì)分析采用精確概率法檢驗(yàn)

Note: The statistical analysis is tested by Fisher’s exact probabilities method

2.3病毒特異性IgM、IgG抗體動(dòng)態(tài)特征對(duì)34對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行IgM和IgG抗體動(dòng)態(tài)特征觀察，IgM抗體在發(fā)病第2天即可檢出，最晚檢出時(shí)間為發(fā)病后第74天，30～60 d內(nèi)采集標(biāo)本，IgM抗體陽(yáng)性率達(dá)75%，60 d后IgM抗體陽(yáng)性率迅速下降為22.22%。30～60 d時(shí)間組，吸光度均值和抗體陽(yáng)性率最高，詳見圖1。IgG抗體最早檢出時(shí)間為發(fā)病后第12天，最晚檢出時(shí)間為發(fā)病后100 d。30 d內(nèi)采集標(biāo)本IgG抗體陽(yáng)性率僅為2.78%，30 d以后采集標(biāo)本IgG抗體陽(yáng)性率和吸光度均值均快速上升，并保持較高水平，30～60 d時(shí)間組IgG抗體陽(yáng)性率為100%，如圖1所示。

3　討論

一般病毒感染機(jī)體后，首先出現(xiàn)病毒血癥期，隨后刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，IgM抗體是免疫應(yīng)答中首要分泌的抗體，持續(xù)時(shí)間較短，為現(xiàn)癥感染和早期診斷的指標(biāo)，IgG抗體出現(xiàn)時(shí)間通常較晚，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，一般用于回顧性調(diào)查和作為既往感染的指標(biāo)。不同的病毒具有自身特性，其病毒血癥期持續(xù)時(shí)間以及抗體出現(xiàn)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間不同，開展相關(guān)動(dòng)態(tài)特征的研究，可以為確定標(biāo)本的采集時(shí)間和檢測(cè)方法的正確選擇提供理論依據(jù)。發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南(2010版)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方案中規(guī)定該病的診斷方法包括病原學(xué)和血清學(xué)方法，其中病原學(xué)方法包括：RT-PCR 和Real-time PCR病毒核酸診斷方法、病毒分離培養(yǎng)。血清學(xué)方法包括：血清特異性IgG抗體(ELISA、免疫熒光抗體測(cè)定、中和試驗(yàn)等方法)、血清特異性總抗體(雙抗原夾心ELISA法檢測(cè))[3]，而這些方法的適用條件并沒有進(jìn)行詳細(xì)的描述，基層醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)在選擇和使用相應(yīng)檢測(cè)技術(shù)時(shí)可能存在困惑。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)具有快速、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，因此本研究主要分析兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)病毒RNA和特異性抗體的檢測(cè)結(jié)果，另有研究表明SFTS病毒核蛋白具有較好的免疫原性[10]，所以本文選擇核蛋白為基礎(chǔ)的ELISA檢測(cè)方法來觀察抗體的動(dòng)態(tài)特征。

本次研究發(fā)現(xiàn)，SFTS疑似病例早期標(biāo)本中核酸檢測(cè)有較高的陽(yáng)性檢出率(52.87%)，研究結(jié)果與杜燕華、宮連鳳等一致[11-12]，并且SFTS病毒引起的病毒血癥期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，陽(yáng)性標(biāo)本采樣與發(fā)病時(shí)間間隔均在12 d以內(nèi)，其中7～9 d采集標(biāo)本，陽(yáng)性檢出率最高，達(dá)100%，而IgM抗體(31.03%)和IgG抗體(3.41%)檢出率相對(duì)較低，并且IgM抗體檢測(cè)和PCR檢測(cè)結(jié)果一致率較低。主要考慮兩方法檢測(cè)的目標(biāo)物不同，以及抗體出現(xiàn)時(shí)間較晚有關(guān)。34份確診病例恢復(fù)期血標(biāo)本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IgM抗體陽(yáng)性率為41.18%，與急性期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00)，而IgG抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率高，達(dá)94.12%。黃學(xué)勇等[9]研究發(fā)現(xiàn)間接免疫熒光法檢測(cè)SFTS疑似病例雙份血，IgG抗體陽(yáng)性率達(dá)76.19%，與RT-PCR的檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)論與本研究基本一致，說明雙份血IgG抗體的檢測(cè)對(duì)于疾病的診斷具有重要價(jià)值。

抗體水平動(dòng)態(tài)特征分析發(fā)現(xiàn)：IgM抗體在發(fā)病第2天即可檢出，最晚檢出時(shí)間為發(fā)病后第74天，30～60 d內(nèi)采集標(biāo)本，IgM抗體陽(yáng)性率最高(75%)。IgG抗體最早檢出時(shí)間為發(fā)病后第12天，發(fā)病后100 d采集標(biāo)本中仍能檢出，30 d內(nèi)采集標(biāo)本IgG抗體檢出率僅為2.78%，30 d以后采集標(biāo)本，IgG抗體檢出率和吸光度均值均快速上升，并保持較高水平，研究結(jié)果與劉艷等研究結(jié)論不一致[13]，其研究發(fā)現(xiàn)28例SFTS患者中，IgM、IgG抗體陽(yáng)性檢出率分別為89.3%和85.7%，兩種抗體發(fā)病后5 d開始出現(xiàn)，峰值出現(xiàn)在發(fā)病2周左右，考慮其觀察病例少，隨訪時(shí)間過短有關(guān)。另有研究顯示該病毒中和抗體在SFTS住院病例中可持續(xù)4年甚至更長(zhǎng)時(shí)間[14]，本研究亦未發(fā)現(xiàn)IgG抗體下降的拐點(diǎn)，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，發(fā)病兩周內(nèi)采集的SFTS疑似患者血標(biāo)本，可優(yōu)先考慮使用實(shí)時(shí)熒光PCR方法等檢測(cè)病毒核酸或檢測(cè)IgM抗體。與漢坦病毒等布尼亞病毒不同的是，IgM抗體雖可在發(fā)病2 d后檢出，但檢出高峰出現(xiàn)時(shí)間多較晚，因此檢測(cè)陰性并不能排除診斷。IgG抗體在恢復(fù)期標(biāo)本中陽(yáng)轉(zhuǎn)率高，可作為疾病診斷的輔助手段。

利益沖突：無(wú)

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