基因芯片研究針刺人迎穴對SHR主動脈弓基因表達的影響

馬 田，郭 妍，蘆 娟，趙瑞利，LIM ANNA，石學敏，郭長青*

（ 1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029；2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

原發(fā)性高血壓?。‥H）的主要臨床表現(xiàn)為血壓升高，常伴發(fā)心、腦、腎等靶器官功能性和（或）器質(zhì)性病變[1]，近年來其患病率、致殘率、致死率居高不下，且絕對和相對發(fā)病率均有增多的趨勢[2]。EH的發(fā)生發(fā)展過程中靶器官損害的共同病理學基礎(chǔ)——血管重構(gòu)（VR）起著至關(guān)重要的作用。 VR既是高血壓重要的病理變化，又是高血壓維持、惡化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，隨著學者對細胞外基質(zhì)受體相互作用通路（ECM-receptor interaction pathway）研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在高血壓血管重構(gòu)中起到十分重要的作用[3]。作為公認的與人類EH最相似的動物模型，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）在目前EH實驗研究中最為常用[4-5]。心血管系統(tǒng)疾病屬于與多基因位點變異和表達異常有關(guān)的復雜性疾病，傳統(tǒng)的單因素檢測方法已不能滿足研究需求，需要更先進的檢測技術(shù)來實現(xiàn)對心血管系統(tǒng)疾病的研究[6]。基因芯片技術(shù)可一次性平行分析數(shù)以萬計個基因mRNA表達情況，同時可檢測到信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡(luò)中多個節(jié)點的基因的信息表達，可更好地滿足心血管系統(tǒng)疾病研究的需求[7-9]。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SHR 20只，Wistar Kyoto（WKY）大鼠10只，清潔級，雄性9周齡，體質(zhì)量180～200 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號： SCXK（京）200223。用筆在SHR尾部標記序號，并按照 EXCEL 隨機數(shù)字表法將20只SHR隨機分為模型組、人迎組，每組10只；10只WKY大鼠作為空白組。

1.2 器材與儀器 器材：中研太和牌一次性無菌針灸針：0.16 mm × 7 mm（ 購自北京中研太和醫(yī)療器械有限公司）；手術(shù)器械、凝膠促凝管（ 購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學技術(shù)有限公司）；凍存管（購自北京康暉煜科技有限公司）；EP 管(購自北京健力園醫(yī)療器械有限公司）。儀器： 小動物斷頭器（購自北京碩林苑科技有限公司），動物無創(chuàng)血壓儀（型號：BP - 6）、電子天平（型號： ER - 182A）。

1.3 針刺穴位選取 針刺“人迎穴”?！秾嶒炨樉膶W》教材取穴：在頸部三角區(qū)內(nèi)，當胸骨舌骨肌與胸鎖乳突肌上緣交點，約為頸總動脈分叉處，體表可觸及搏動。參照文獻[10]取大鼠頸前兩側(cè)下頜骨隅突連線下8 mm，前正中線旁開3.5 mm。

1.4 針刺操作 人迎組：將大鼠束縛于自制鼠套中，露出頸部，以右手為刺手，取雙側(cè)“人迎穴”，針灸針直刺 4～5 mm。刺入后以針體微微顫動為準，行捻轉(zhuǎn)平補平瀉法1 min，留針19 min。每天中午12:00治療1次，每針刺6 d休息1 d，共針刺4周，所有針剌操作均由同1人完成。模型組與空白組：將大鼠束縛于自制鼠套內(nèi)20 min，不做任何干預。

1.5 血壓測量 在針刺干預第1、5、9、13、 17、21、25、28天測量各組大鼠尾動脈收縮壓。每只大鼠測量3次并取平均值；動作輕柔避免激惹引起大鼠的血壓波動；加溫時間要控制在15 min以內(nèi)，避免高溫導致大鼠死亡；鼠套和尾套尺寸合適，周圍無噪聲，環(huán)境溫度恒定。應用 SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。各組間差異采用單因素方差分析。P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.6 實驗取材 各組大鼠麻醉狀態(tài)下立即處死并取材，取主動脈弓處約2～3 mm主動脈一段，將殘留的結(jié)締組織剝離干凈，漂洗后用濾紙吸干水分放入凍存管，將凍存管放入液氮中于- 80 ℃冰箱保存。

1.7 基因芯片檢測 將空白組、模型組和人迎組全部主動脈弓樣本各取出100 mg，研磨均勻成粉末狀，提取總RNA；使用NanoDrop 1 000核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度，使用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性；按照以下步驟制備基因芯片表達譜：制備Poly-A RNA質(zhì)控，合成第一鏈cDNA和第二鏈cDNA，再合成cRNA的體外逆轉(zhuǎn)錄，對cRNA進行純化，隨后合成第二輪單鏈cDNA，使用RNaseH水解RNA，純化第二輪單鏈cDNA并片段化和標記單鏈cDNA；按照以下步驟進行芯片雜交：制備雜交反應混合液，添加雜交反應混合液到片段化與祿記后的單鏈cDNA，進行雜交芯片注入；芯片雜交后進行洗染，洗染結(jié)束后，檢查芯片表面玻璃有無氣泡，灰塵等，仔細擦拭芯片表面，然后使用Affymetrix Gene Chip 7G microarray scanner掃描芯片。

將掃描的CEL格式圖像輸入到Affymetrix Expression console software，對基因芯片圖像進行數(shù)據(jù)分析，應用Robust Multichip Average 計算方法對基因數(shù)據(jù)進行歸一化處理之后，用熒光共聚焦顯微鏡掃讀結(jié)果進行比較分析，得到各組基因的熒光信號強度，由于正確堿基互補雙鏈具有較高的熱力學穩(wěn)定性，因此，探針與樣品分子在某位點配對有差異時該位點的熒光強度就會有所不同。將空白組與模型組的基因的熒光信號強度進行比較，將模型組與人迎組的基因的熒光信號強度進行比較，并用Transcriptome Analysis console對比較的比值進行分析，判斷基因差異表達的標準及篩選出樣本之間的差異表達基因：兩個基因比值的fold change≥ 1.5為表達上調(diào)，fold change≤-1.5為表達下調(diào)，-1.5～1.5之間為不存在顯著表達差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓比較 28 d后，模型組大鼠收縮壓由（165.5±14）mmHg上 升 至（187.6±1） mmHg，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與空白組相比，人迎組大鼠收縮壓在針刺第1、5、9、13、17、21、25、28天均呈上升趨勢（P＜0.01）；與模型組相比，人迎組大鼠收縮壓第9天（P＜0.01）和13、17、21、25、28天（P＜0.05） 明顯下降（P＜0.05），說明針刺人迎穴對于降低SHR的血壓具有較好的短期效應。見圖1。

圖1 各組大鼠收縮壓測量值

2.2 基因芯片篩查結(jié)果 模型組和空白組比較： 452個基因表達上調(diào)，245個基因表達下調(diào)； 針刺干預后人迎組和模型組比較： 261個基因表達上調(diào)，986個基因表達下調(diào)。經(jīng)統(tǒng)計，有 102個基因在模型組和人迎組均發(fā)生顯著性表達差異，其中有86個基因表達在模型組中升高，在人迎組中降低，有16個基因表達在模型組中降低，在人迎組中升高（Fold Change≥ 1.5或≤-1.5，P＜0.05）。

2.3 KEGG信號通路分析 如表1所示：與空白組相比，模型組有12條通路被激活，與模型組相比較，人迎組有10條通路被激活（P＜0.05）。其中細胞外基質(zhì)受體相互作用通路（ECM-receptor interaction）中，有12個基因在模型組VS空白組、人迎組VS模型組都出現(xiàn)差異性表達，分別為：LAMA2, CD36, LAMC3,LAMA5, COL2A1, ITGA3, LAMC1, LAMB1, SV2C,COL5A2, FN1, SPP1；且在模型組VS空白組皆表達上調(diào)，在人迎組VS模型組皆表達下調(diào)（Fold Change≥ 1.5或≤-1.5，P＜0.05）。

表1 KEGG信號通路分析顯示的被激活通路

3 討論

本實驗顯示，針刺人迎穴能明顯地降低SHR的血壓。人迎穴屬足陽明胃經(jīng)穴，“氣?！彼鲋T戶，多條經(jīng)脈經(jīng)氣相通，有通達氣血之功[11]。根據(jù)人迎穴定位來分析，組織深部的頸動脈竇及相關(guān)神經(jīng)、血管為降壓效應的重要結(jié)構(gòu)。其壓力感受器接受刺激后傳入中樞，傳出作用于相應效應器，而產(chǎn)生降壓效果[12-13]。本實驗運用基因芯片技術(shù)檢測出大鼠在針刺干預前后主動脈弓基因表達的差異，提示針刺人迎穴可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達而產(chǎn)生降壓作用。

研究[14]表明，高血壓狀態(tài)下的VSMCs增殖—凋亡平衡失調(diào)是高血壓血管重構(gòu)的中心環(huán)節(jié)之一。本實驗模型組VS空白組轉(zhuǎn)錄翻譯LN與 FN的基因表達均上調(diào)，人迎組VS模型組的相同基因的表達均下調(diào)，提示針刺人迎穴可能通過調(diào)控細胞外基質(zhì)受體相互作用通路，抑制LAMA2、LAMC3、LAMA5、LAMC1、LAMB1、Fn1等基因的表達，減少LN、 FN的生成，改善主動脈血管重構(gòu)，從而降低SHR大鼠的收縮壓和舒張壓。后續(xù)實驗可對關(guān)鍵基因進行實時定量熒光分析，以進一步驗證本實驗結(jié)果，以及明確針刺人迎穴對于高血壓血管重構(gòu)的相關(guān)機制。

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