痛瀉安腸方對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結(jié)腸TRPV1表達(dá)及血漿SP、CGRP含量的影響

韓亞飛 ，王允亮，郭 一，石 磊，賈博宜，李軍祥*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100078）

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是臨床上常見的功能性胃腸道疾病，以反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉為主要表現(xiàn)，同時可伴有腹脹或腹部膨脹的癥狀[1]。目前，IBS-D的發(fā)病機(jī)制尚未明確。本研究通過觀察痛瀉安腸方對IBS-D大鼠結(jié)腸TRPV1和血清SP、CGRP的影響，初步探討痛瀉安腸方治療IBS-D的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（120±20）g，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2016-0002，飼養(yǎng)在北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院動物中心。實驗全程牢牢遵守動物福利的指導(dǎo)準(zhǔn)則，即以減少（Reduction）、替代（Replacement）和優(yōu)化（Refinement）為核心的“3R”原則。

1.2 試劑 痛瀉安腸方水煎劑（炒白術(shù)15 g，炮姜9 g，炒白芍12 g，烏梅9 g，蜘蛛香6 g，黃連6 g，蟬蛻6 g，0.5 g生藥/mL）購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房，匹維溴銨片（得舒特，法國蘇威特，批號：H20070059）購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥房。乙酸、液體石蠟（北京化學(xué)試劑公司）；MEDEX中心靜脈導(dǎo)管（單腔）（美國）；實時熒光定量試劑盒（ 寶生物公司）；總RNA提取試劑、RIPA總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（Sigma公司）；GAPDH鼠單抗、山羊抗兔IgG（H+L）/ HRP（Jackson公司）；SP ELISA Kit、CGRP ELISA Kit（武漢華美公司）；MultiSkan3酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）、ABI7500熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 制備模型前運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、痛瀉安腸方高劑量組（按正常人用標(biāo)準(zhǔn)計量2倍換算）、痛瀉安腸方中劑量組（按正常人用標(biāo)準(zhǔn)計量換算）、痛瀉安腸方低劑量組（按正常人用標(biāo)準(zhǔn)計量1/2倍換算）和匹維溴銨組，每組10只。參照AL-Chaer ED[2]的造模方法，將大鼠倒置，用石蠟將中心靜脈導(dǎo)管潤滑，將0.5% 的冰醋酸經(jīng)肛門插入距肛緣3～5 cm處，灌注量從0.2 mL開始，逐漸增加至0.7 mL，持續(xù)2周。用石蠟將雙腔導(dǎo)尿管球囊端潤滑，經(jīng)肛門插入距肛緣2～3 cm處，向球囊中充氣1.5～2.0 mL/次，以大鼠出現(xiàn)腹部收縮為度，共擴(kuò)張3次，同時給予夾尾刺激，持續(xù)時間3～5 min，持續(xù)2周。在冰醋酸灌腸、球囊直腸刺激聯(lián)合夾尾刺激的同時予番瀉葉濃縮劑（0.5 g/mL）灌胃，給藥體積為20 mL/（kg·d），持續(xù)4周。

1.3.2 標(biāo)本采集 末次給藥后，將大鼠禁食禁水24 h，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，抽取大鼠腹主動脈血，靜置后分離血清，分裝- 80 ℃保存。取距離大鼠肛門約8 cm處的結(jié)腸組織，放入凍存管內(nèi)，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈后置于液氮內(nèi)凍存，之后放入到- 80 ℃冰箱備用。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 內(nèi)臟敏感性評價 腹壁撤退反射（AWR）評分檢測大鼠內(nèi)臟敏感性。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)[3]：0分，結(jié)直腸擴(kuò)張刺激時大鼠情緒基本穩(wěn)定；1分，給予刺激時變得開始不穩(wěn)定，偶爾扭動頭部；2分，給予刺激時腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分，刺激時腹背部肌肉較強(qiáng)烈收縮并出現(xiàn)腹部抬離地面的情況；4分，腹部肌肉強(qiáng)烈收縮，腹部呈弓形，并把腹部、會陰部抬離地面。

1.4.2 糞便 Bristol分級評分 糞便 Bristol分級評分檢測大鼠的腹瀉情況。糞便 Bristol分級評分標(biāo)準(zhǔn)[4]：1型：分散的硬塊，如堅果；2型：臘腸狀，成塊的；3型：臘腸狀，表面有裂縫；4型：臘腸狀或蛇狀，光滑而柔軟；5型： 柔軟團(tuán)塊，邊緣清楚；6型：絨狀便，邊緣不清，或糊狀糞；7型：水樣糞，無固狀物。

1.4.3 結(jié)腸TRPV1和TRPV1 mRNA的檢測 采用Western blot檢測TRPV1的表達(dá)。提取蛋白，預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑，加入BSA標(biāo)準(zhǔn)液，檢測樣品蛋白含量；以RIPA調(diào)整蛋白濃度，分別加入一抗、二抗，洗膜后進(jìn)行凝膠圖像分析，得出數(shù)值。采用Real-TimePCR檢測TRPV1 mRNA的表達(dá)。進(jìn)行引物設(shè)計，提取組織樣本RNA，測定RNA濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以2-△△ct作為目地基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析。

1.4.4 血清SP、CGRP的檢測 Elisa測定血清SP和CGRP的表達(dá)。將試劑盒平衡至室溫，按試劑盒說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加樣后用洗滌液洗滌4次并拍干，加入HRP標(biāo)記的二抗，依次加入顯色劑A和B，37 ℃避光反應(yīng)15～30 min，加入50 μL終止液，450 nm波長下讀取吸光值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式表示，對符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，其組間差異采用單因素方差分析，不服從正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)臟敏感性評價 見表1。

表1 治療前后各組大鼠AWR評分比較（，n = 10） 分

表1 治療前后各組大鼠AWR評分比較（，n = 10） 分

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.05，△△ P＜0.01

組 別 治療前治療后1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL 1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL空白組 0.75±0.27 1.72±0.68 2.95±0.60 0.80±0.19 1.83±0.19 2.92±0.34模型組 1.38±0.61 2.88±0.58## 3.48±0.50 1.33±0.43# 2.92±0.24△△ 3.45±0.45#低劑量組 1.47±0.50# 2.92±0.80## 3.62±0.45# 0.85±0.36△ 2.05±0.39△△ 2.98±0.34△中劑量組 1.50±0.70# 2.55±0.61# 3.38±0.53 1.00±0.34 1.88±0.27△△ 2.95±0.36△高劑量組 1.28±0.51 2.67±0.55# 3.42±0.61 0.90±0.36△ 2.00±0.34△△ 3.08±0.27得舒特組 1.45±0.70# 2.87±0.47## 3.50±0.58 0.93±0.33 2.12±0.55△△ 3.05±0.36

2.2 糞便 Bristol分級評分 見表2。

表2 大鼠糞便Bristol分級評分比較（，n = 10）分

表2 大鼠糞便Bristol分級評分比較（，n = 10）分

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 第28天 第42天空白組 4.58±0.38 4.42±0.38模型組 6.25±0.27## 6.34±0.41##低劑量組 6.33±0.41## 4.50±0.45△△中劑量組 6.17±0.26## 4.75±0.27△△高劑量組 6.17±0.52## 4.58±0.58△△得舒特組 6.42±0.38## 4.67±0.75△△

2.3 結(jié)腸TRPV1蛋白和TRPV1 mRNA表達(dá)檢測結(jié)果 見表3。

表3 大鼠結(jié)腸TRPV1蛋白表達(dá)灰度值及TRPV1 mRNA的比較 （，n = 6）

表3 大鼠結(jié)腸TRPV1蛋白表達(dá)灰度值及TRPV1 mRNA的比較 （，n = 6）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 TRPV1/GAPDH TRPV1/2-△△ct空白組 0.98±0.52 1.26±0.26模型組 2.51±0.42# 2.17±0.60##低劑量組 0.61±0.52△△ 1.33±0.15△△中劑量組 0.90±0.82△△ 1.20±0.37△△高劑量組 1.95±0.41 0.90±0.13△△得舒特組 1.96±0.16 1.35±0.15△△

2.4 血清指標(biāo)的檢測結(jié)果 見表4。

表4 各組大鼠血清SP、CGRP的表達(dá)比較（，n = 10）

表4 各組大鼠血清SP、CGRP的表達(dá)比較（，n = 10）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.05，△△ P＜0.01

組 別 SP CGRP空白組 97.69±8.61 12.31±1.37模型組 124.19±8.06## 14.98±1.67##低劑量組 100.55±10.31△△ 13.03±1.47△中劑量組 97.77±7.32△△ 13.13±0.80△高劑量組 95.73±9.33△△ 12.55±1.83△△得舒特組 101.99±6.55△△ 13.93±1.54△

3 討論

瞬時受體電位香草酸亞型-1（TRPV1）是一種產(chǎn)生痛覺過敏和病理性疼痛傷害性感受分子，在IBS內(nèi)臟高敏感性發(fā)生中具有關(guān)鍵作用[5]。研究[6-7]證實，內(nèi)臟敏感性增加是本病發(fā)病的關(guān)鍵因素；TRPV1在 IBS患者乙狀結(jié)腸的表達(dá)較正常人更高，并與患者的腹痛嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。亦有研究[8]發(fā)現(xiàn)，感覺神經(jīng)元TRPV1表達(dá)上調(diào)與內(nèi)臟高敏感性疼痛的發(fā)生密切相關(guān)，是啟動并保持胃腸道高敏感性的重要分子。TRPV1基因敲除可以降低胃腸道傳入神經(jīng)在擴(kuò)張刺激下的機(jī)械敏感性[9]。SP和CGRP作為感覺神經(jīng)傳遞介質(zhì)，廣泛分布于外周以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。SP 能通過強(qiáng)烈刺激消化道平滑肌，增強(qiáng)胃腸蠕動，產(chǎn)生腹痛或腹部不適癥狀[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，IBS大鼠血漿中SP含量明顯升高，腸道痛閾降低從而出現(xiàn)腸道過敏。CGRP能夠調(diào)節(jié)胃腸分泌和運(yùn)動功能，加快結(jié)腸的蠕動，導(dǎo)致腹痛、腸鳴及腹瀉等臨床癥狀[12]。研究[13]顯示，血漿CGRP水平在IBS 發(fā)病中發(fā)揮著重要作用，提示CGRP的升高與內(nèi)臟高敏感性密切相關(guān)。

痛瀉安腸方是導(dǎo)師李軍祥教授經(jīng)過多年臨床總結(jié)的臨床經(jīng)驗方，在IBS-D的治療中取得了顯著的療效。方中白術(shù)苦甘而溫，補(bǔ)脾燥濕以治土虛，為君藥；炮姜性溫，善暖脾胃，能溫中止痛止瀉，與白術(shù)共為君藥。白芍酸寒，柔肝緩急止痛，與白術(shù)相配，收健脾止瀉之功；味酸入肝，與白芍相配則加強(qiáng)柔肝止痛之力，與白芍共為臣藥。蜘蛛香辛苦而溫，理氣中瀉木；烏梅酸澀性平，能澀腸止瀉，與白術(shù)相配以止痛，除濕止瀉；黃連清熱燥濕，厚腸止瀉；蟬蛻氣味甘寒，乃清虛之品，能祛風(fēng)而勝濕，與黃連相配，防止?jié)裥叭肜锘療?，與蜘蛛香、黃連共為佐藥。諸藥相伍，是仿痛瀉要方之義，使脾健肝舒，氣機(jī)調(diào)暢，痛瀉自止[14]。

本研究顯示，IBS-D大鼠內(nèi)臟敏感性閾值下降，糞便含水量和糞便Bristol分級評分均明顯升高，結(jié)腸組織TRPV1蛋白表達(dá)升高，結(jié)腸TRPV1 mRNA表達(dá)升高，血清SP、CGRP水平升高；痛瀉安腸方治療后內(nèi)臟敏感性閾值升高，大鼠糞便含水量和糞便Bristol分級評分降低，且接近空白組，結(jié)腸組織TRPV1蛋白表達(dá)下降， TRPV1 mRNA表達(dá)降低，血清SP、CGRP水平下降，說明痛瀉安腸方能上調(diào)內(nèi)臟敏感性閾值，下調(diào)結(jié)腸組織TRPV1蛋白表達(dá)，降低結(jié)腸TRPV1 mRNA的表達(dá)，降低血清SP、CGRP水平，達(dá)到治療IBS-D的目的。

但是，實驗結(jié)果顯示，高劑量組和得舒特組大鼠結(jié)腸組織中TRPV1蛋白和TRPV1 mRNA的表達(dá)并不完全一致，其中TRPV1蛋白在治療前后并未發(fā)生明顯改變，腸道功能的變化是否主要體現(xiàn)在蛋白的表達(dá)上以及基因是否參與腸道功能的變化仍需進(jìn)一步驗證，TRPV1蛋白的表達(dá)是否與和TRPV1 mRNA的表達(dá)同步尚需進(jìn)一步研究。

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