熱提取法和離心柱吸附法提取DNA病原的比較

梁柱良，王瑞深

（深圳市光明新區(qū)動植物檢驗檢測中心，深圳518107）

1　實驗器材和耗材

ABI7500實時熒光PCR儀，雅馬拓DKM610C送風定溫恒溫器，ESCOAC2-4S1生物安全柜，Eppendorf5424微量離心機，移液槍，無核酸EP管，熱提取法試劑、離心柱吸附法試劑盒和熒光PCR試劑盒均選擇在有效期內(nèi)廣州某生物科技有限公司的產(chǎn)品等。

2　實驗方法

2.1　分組

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2.2　提取

2.2.1熱提取法：50μl已研磨處理后樣品加入50μl核酸提取液，100℃恒溫處理10min，13000rpm離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新1.5mlEP管，-20℃保存待用。

2.2.2離心柱吸附法：100μl已研磨處理后樣品按廣州某生物科技有限公司的離心柱吸附法試劑盒的產(chǎn)品說明書提取后-20℃保存待用。

2.3　上機

按廣州某生物科技有限公司熒光PCR試劑盒的產(chǎn)品說明書操作，熒光通道為FAM，反應體系為25μl。

3　實驗結(jié)果

圖1豬丹毒桿菌熒光PCR圖

圖2豬圓環(huán)2型病毒熒光PCR圖

陰性和陽性質(zhì)控品符合豬丹毒桿菌和豬圓環(huán)2型熒光PCR試劑盒的質(zhì)控標準，實驗有效?，F(xiàn)整理實驗結(jié)果如下：

4　分析討論

表1　豬丹毒桿菌熒光PCR結(jié)果分析

表2　豬圓環(huán)2型病毒熒光PCR結(jié)果分析

根據(jù)此次實驗結(jié)果可以分析得出，熱提取法和離心柱吸附法提取豬丹毒桿菌和豬圓環(huán)2型病毒陽性組織樣品和10*陽性對照樣品DNA后進行熒光PCR實驗定性檢測結(jié)果的準確率均為100%，二者在準確性上無差異；熱提取法上機CT值RSD%范圍在0.25～3.31內(nèi)，離心柱吸附法上機CT值RSD%范圍在0.55～1.91內(nèi)，兩者均在可接受范圍內(nèi)，無明顯區(qū)別。熱提取法操作簡單，耗時少，實驗儀器需要能達到100℃的恒溫箱，儀器條件要求較高，較適合任務急和批量大的檢測任務；離心柱吸附法操作要求較嚴格，實驗過程中需要多次轉(zhuǎn)移液體，容易產(chǎn)生交叉污染，但去雜質(zhì)提純能力強，適合需要開展下游實驗的核酸提取實驗。