利用鹽酸-正丁醇法測定蒙農(nóng)紅豆草縮合單寧的含量

劉秀麗 ，畢力格吐 ，李樹森 ，韓文芳 ，李 鋒 ，裴 樂 ，侯勇躍 ，李元恒 ，劉 威

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，呼和浩特010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特010018；3.正藍(lán)旗牧草種籽繁殖場，正藍(lán)旗 027200；4.巴彥淖爾市動物疫病預(yù)防控制中心，巴彥淖爾015000；5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特010010）

紅豆草（Onobrychis viciifolia,Sainfoin）是國內(nèi)外廣泛栽培的優(yōu)良豆科類牧草，也叫驢食豆、驢喜豆，原產(chǎn)歐洲，素有“牧草皇后”、“圣草”之稱，對草原畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有一定的競爭力地位[1]，被認(rèn)為是解決紫花苜蓿引起牲畜臌脹病的一種理想牧草[2-3]。紅豆草在內(nèi)蒙古、寧夏、陜西等省區(qū)種植較多，新疆天山北陰坡處有野生分布。耐旱性強(qiáng)，是非灌溉條件下不可代替的牧草，且產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值高、適口性好，而且富含單寧，所以在發(fā)展畜牧業(yè)和改善環(huán)境等方面發(fā)揮著日益重要的作用。目前，生產(chǎn)和應(yīng)用的主要品種有5個[4]；蒙農(nóng)紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Mengnong,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)育成,1995年經(jīng)全國草品種審定委員會審定登記，優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)）；甘肅紅豆草 (Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Gansu,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)育成）；頓河紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Taneitica spreng，分布在新疆天山、阿爾泰地區(qū)，一個抗寒力強(qiáng)、蛋白含量高、適口性好的優(yōu)良野生品種）；麥羅斯紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Melrose,加拿大育成品種）和埃斯基紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv.Eski,美國蒙大拿農(nóng)業(yè)試驗(yàn)中心)。其中，蒙農(nóng)紅豆草已在內(nèi)蒙古中、西部干旱、半干旱地區(qū)及寧夏等地大面積種植。紅豆草在生長的各個階段都富含單寧，且動物喜食。研究表明，反芻動物采食含單寧飼料后，可以減少瘤胃可降解蛋白質(zhì)的數(shù)量，提高蛋白質(zhì)的利用效率，也能有效提高動物的生產(chǎn)性能；如羊毛產(chǎn)量、泌乳量、肉品品質(zhì)等；且單寧具有抗菌、抗寄生蟲、抑制反芻動物瘤胃膨脹等的作用，臨床可以在生長期采集與苜?；旌巷曃狗乐狗雌c動物膨脹病發(fā)生，或者將粗提單寧制成飼料添加劑指導(dǎo)臨床飼喂，防止寄生蟲病及減少致病菌的排出，減少臨床抗生素藥物的使用，提高畜產(chǎn)品質(zhì)量，為健康綠色養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)，所以值得大力開發(fā)和利用。關(guān)于我區(qū)的蒙農(nóng)紅豆草研究主要集中于種子特性、出苗率等方面，未有對紅豆草單寧含量測定的報道。本試驗(yàn)的主要目的是測定我區(qū)蒙農(nóng)紅豆草縮合單寧含量，以期為將來進(jìn)一步開發(fā)利用紅豆草及單寧提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

蒙農(nóng)紅豆草：采用自種試驗(yàn)田的生長期（4～5月）、開花期（5～6 月）、成熟期（7～8 月）的全植株、莖和葉子，50℃烘干并磨碎過1mm篩孔，備用。

紅豆草單寧純品：由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提取，純度≥98%。

1.2　主要試劑

丙酮(北京化工廠，20140918)；正丁醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，20140312)；乙醚(USA，095179)。

1.3　主要的儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52CS-1),真空冷凍干燥機(jī)（SJIA-N），紫外-可見分光光度計（UV1000），24 針氮?dú)獯蹈蓛x（Organomation），交聯(lián)葡聚糖柱（Sephadex LH-20）。

1.4　實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1可提取縮合單寧(extractable condensed tannin,ECT)的含量測定

1.4.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

取紅豆草單寧純品作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用儲備液（濃度為1.0mg/mL）配制5個標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度分別為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0mg/mL。分別配制2mL各濃度標(biāo)準(zhǔn)液到5mL的離心管中，搖勻，備用。

1.4.1.2可提取縮合單寧的含量測定

（1）單寧提取液的制備稱取200±0.1g備用樣品置于50mL離心管中，加入8mL提取試劑（70%丙酮），旋渦混勻后室溫放置20min，每5min渦1次，3500g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一50mL試管中。重復(fù)提取2～3次后，合并上清液，沉淀放4℃保存，以用來測定蛋白結(jié)合單寧 (protein-bound condensed tannin,PCT)含量。在上清液中加入24mL乙醚，混勻后，室溫放置2min，如果沒出現(xiàn)分層，繼續(xù)加乙醚，直到分層，棄去上層溶液，保留下層。利用氮?dú)獯蹈蓛x40℃吹3h，取出后加去離子水到50mL,混勻。如果有雜質(zhì)，取4mL水溶液，15000g離心5min即可。放置4℃待測。

（2）可提取縮合單寧含量測定取出1mL標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.4.1.1）及待測樣品到15mL螺口試管中，加入6mL測定試劑（l-正丁醇∶36%鹽酸 95∶5），充分混勻，沸水浴中放置 75min，拿出后冰浴。在550nm的紫外分光光度計下讀數(shù)。

1.4.2蛋白結(jié)合單寧含量的測定

1.4.2.1單寧提取液的制備 在可溶性縮合單寧提取后的沉淀中，加入4mL提取試劑A（用 10mMtris/chloride溶液制成10%（W/V），再加入 20%的 2-巰基乙醇），混勻，室溫放置 20min，再混勻，放入沸水中45min，再放入冷水中冷卻到室溫 （19℃～24℃），3500g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到15mL螺口試管中，再重復(fù)提取2次，合并上清液。用提取試劑A再沖洗沉淀2～3次，使體積達(dá)到15mL，混勻，作為待測樣品。將沉淀放4℃保存，以用來測纖維結(jié)合單寧（FCT,fiber-bound condensed tannin,FCT）。

1.4.2.2蛋白結(jié)合單寧含量測定 取待測樣品2mL，15000g離心5min，作為待測樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線以及測定方法同1.4.1.2(2)。

1.4.3纖維結(jié)合單寧含量的測定

1.4.3.1單寧提取液的制備 提取蛋白結(jié)合單寧后的殘渣，再加入 10mL 的測定試劑（1-正丁醇-36%鹽酸，V∶V，95∶5）和 1mL的提取試劑A，混勻后，室溫放置10min，混勻。取1.5mL離心，15000g離5min，上清液待測。

1.4.3.2纖維結(jié)合單寧含量測定 取待測樣品2mL，15000g離心5min，作為待測樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線以及測定方法同1.4.1.2(2)。

1.5　總縮合單寧含量測定

總縮合單寧含量為可提取縮合單寧、蛋白結(jié)合單寧和纖維結(jié)合單寧的和。

1.6　數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)誤差均采用EXCEL函數(shù)計算。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過Mixed程序進(jìn)行方差分析（SAS9.0），采用單因素ANOVA分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1　可溶性縮合單寧含量的測定

如圖1、圖2所示，蒙農(nóng)紅豆草全植株可提取縮合單寧含量分別為：生長期131.44g.Kg-1DM(Drymatter,DM)，開花期 78.06g.Kg-1DM，成熟期41.61g.Kg-1DM；蒙農(nóng)紅豆草不論是全植株、莖、葉子中可提取縮合單寧的含量均為生長期最高（P＜0.05）；蒙農(nóng)紅豆草在各個生長階段中均是葉子中含有的可提取縮合單寧比莖中的含量高(P＜0.01)，生長期葉子中可達(dá)156.93g.Kg-1DM，隨著植株的生長成熟，可提取縮合單寧的含量在逐漸下降，成熟期時莖中含量幾乎降為零。

2.2　總縮合單寧含量的測定

如表1所示，蒙農(nóng)紅豆草所含單寧以可提取縮合單寧為主，約占到總縮合單寧含量的83.4%～92.5%，基本同Terrill所述[5]。所以，通常所說的紅豆草單寧就是指可提取縮合單寧。在不同生長階段生長期的全植株總縮合單寧顯著高于開花期和成熟期（P＜0.05），不同生長時期總縮合單寧含量均為葉子比莖高 （P＜0.01）。

3　討論

3.1　植物單寧的提取方法

圖1蒙農(nóng)紅豆草在不同生長期全植株可提取縮合單寧的含量(g.Kg-1 DM)

圖2蒙農(nóng)紅豆草在不同生長期莖和葉子中可提取縮合單寧的含量(g.Kg-1 DM)

表1　蒙農(nóng)紅豆草不同生長時期的莖、葉和全植株中總縮合單寧的含量（g.Kg-1 DM）

關(guān)于植物單寧提取方法很多，但一般從植株中分離縮合單寧采用極性溶劑。據(jù)資料顯示，有研究者用50%甲醇溶液提取高粱單寧；用70%甲醇溶液（其中含0.5%甲酸和0.05%抗壞血酸）提取豆科植物單寧；用75%丙酮溶液提取紅豆草單寧；用合成酒（80%乙醇溶液中含有0.7g/L的酒石酸和1.11g/L的酒石酸氫鉀）從葡萄籽中提取花青素。本實(shí)驗(yàn)采用了目前實(shí)驗(yàn)室常用的提取方法：70%丙酮溶液（0.1%抗壞血酸）。

3.2　含量測定

測定縮合單寧常用的方法是鹽酸/丁醇法，是因?yàn)樵ㄉ卦跓崴釛l件下能夠水解產(chǎn)生性質(zhì)穩(wěn)定的紅色物質(zhì)花色素，可以在暗處保存幾天不變色。其中，在測定單寧過程中，標(biāo)準(zhǔn)品選擇是非常重要的，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品才能夠?qū)崿F(xiàn)較準(zhǔn)確的定量分析。即便是同種牧草，在不同時期不同地點(diǎn)收獲的樣品，單寧的含量差異性也會較大。所以，最好是能夠利用待測樣品自身提取并純化后的單寧來作為標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3　影響縮合單寧合成的因素

實(shí)驗(yàn)表明，蒙農(nóng)紅豆草縮合單寧含量隨著植株的成熟度增加而降低。這主要是因?yàn)榧t豆草所含縮合單寧大部分都存在于葉子中，隨著植株的不斷成熟，縮合單寧在葉子中濃度下降有關(guān)系。紅豆草的分子量范圍為6000～28000Da，單寧僅是多酚的一部分；植物組織合成單寧的量會受很多因素影響，包括植物品種、植株不同部位、成熟度、土壤肥力、生長季節(jié)和溫度及水分等，且同一植物在不同組織中單寧的合成可能是有不同的控制途徑，這還需要進(jìn)一步研究確證。

4　結(jié)論

蒙農(nóng)紅豆草所含縮合單寧占總縮合單寧含量的83.4%～92.5%；生長期所含縮合單寧含量最高；且主要分布在葉子上，可達(dá)156.93g.Kg-1DM。

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