加米霉素注射液的靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)

顏曉冬, 齊 鵬, 宋 敏, 牛志強(qiáng), 張 剛, 卜仕金, 梁景樂(lè), 王九峰

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 北京 海淀100193 ;2. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司, 北京 豐臺(tái)100070 ;3.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州225009)

加米霉素(Gamithromycin)屬于一種新型大環(huán)內(nèi)酯類獸用抗生素,白色至類白色晶體粉末,不溶于水,略有吸濕性,在高溫條件下穩(wěn)定,對(duì)光不敏感,具有18 個(gè)手性中心,重結(jié)晶后只有一種穩(wěn)定晶體構(gòu)型。 化學(xué)名(IUPAC)為：( 2R,3S,4R,5S,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-13-[( 2,6-二脫氧-3-C-甲基-3-O-甲基-α-L-核-己吡喃糖基) 氧]-2-乙基-3,4,10-三羥基-3,5,8,10,12,14-六甲基-7-丙基-11-[[3,4,6-三脫氧-3-( 二甲氨基)-β-D-木-己吡喃糖基]氧]-1-氧雜-7-氮雜環(huán)十五烷-15-酮,分子式為C40H76N2O12,分子量為777.04[1-2]。 具有吸收快、分布廣、作用時(shí)間長(zhǎng)、體內(nèi)殘留低、安全高效、靶組織-肺臟中長(zhǎng)時(shí)間維持有效濃度等優(yōu)點(diǎn)[3]。 法國(guó)梅里亞(MERIAL)動(dòng)物保健有限公司開(kāi)發(fā)了以加米霉素為活性成分的注射液ZACTRAN?,已在歐盟(EMEA,CVMP,2008)和FDA(NADA, 2011)批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療由溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica),多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)和睡眠嗜組織菌(Histophilus somni)引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病[4-5]。

為客觀評(píng)價(jià)中牧實(shí)業(yè)股份有限公司研制的加米霉素注射液對(duì)牛的安全性,我們參照《獸藥注冊(cè)資料匯編》以及VICH《新獸藥靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)指南》[6],進(jìn)行了加米霉素注射液對(duì)中國(guó)荷斯坦牛犢的安全性試驗(yàn)研究。 通過(guò)分析加米霉素注射液對(duì)受試牛的臨床反應(yīng)、血液生理指標(biāo)、血清生化指標(biāo)和組織病理學(xué)的影響,以明確加米霉素注射液對(duì)靶動(dòng)物牛的安全性,為其在臨床科學(xué)安全使用提供數(shù)據(jù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1 供試藥品 加米霉素注射液,含量100 mL 含15 g(15%),批號(hào)：XYHH D004-1,中牧實(shí)業(yè)股份有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備 血細(xì)胞分析儀(SYSMEX KX-21 公司),全自動(dòng)生化分析儀(AU2700,日本OLYMPUS 公司),生物顯微鏡(XSZ-580A 型,上海中恒公司),離心機(jī)(LD5-2A 型,北京雷勃爾公司),組織切片機(jī)及其他病理學(xué)檢查常用儀器設(shè)備。

1.3 試劑 血液生化指標(biāo)測(cè)定試劑,中生北控生物科技股份有限公司;瑞士染液、結(jié)晶紫染液、中性紅染液等自行配制,蒸餾水,冰醋酸,生理鹽水,磷酸鹽緩沖液。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 24 頭中國(guó)荷斯坦健康牛犢,體重約150 ～200 kg,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)奶牛場(chǎng)提供。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入選標(biāo)準(zhǔn)及適應(yīng)期 入選牛在試驗(yàn)前1 d 須經(jīng)獸醫(yī)檢查確認(rèn)是處于良好的健康狀況。下列情況下的牛應(yīng)從實(shí)驗(yàn)中剔除：(1)適應(yīng)期內(nèi)瀕死的牛;(2)適應(yīng)期內(nèi)生病或受傷的牛;(3)試驗(yàn)期內(nèi)因疾病需要用其他藥物治療的牛。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)前適應(yīng)新環(huán)境一周。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)分組與給藥方案 試驗(yàn)方法參考之前的研究[6-9],24 頭健康牛犢(12 頭公、12 頭母),隨機(jī)分為4 組,每組6 頭,每組分別于第0 天、第5 天和第10 天的上午10 點(diǎn),共給藥3 次,頸部皮下注射。受試牛采用耳號(hào)標(biāo)記識(shí)別,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥劑量如表1。

2.2 安全性試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.2.1 臨床觀察 試驗(yàn)期間對(duì)受試牛進(jìn)行詳細(xì)的臨床觀察,主要包括精神狀態(tài)、食欲、飲水、糞便、聽(tīng)診心音、記錄心率和呼吸頻率、注射部位的變化情況,檢查發(fā)病動(dòng)物的臨床癥狀、發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)等。試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束后分別測(cè)定增重和飼料轉(zhuǎn)化率。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

2.2.2 血液學(xué)和血清生化學(xué)檢測(cè) 在給藥前(第0天)、第2 次給藥(第5 天)和第3 次給藥(第10 天)后的4 ～6 h 內(nèi),對(duì)所有試驗(yàn)牛頸靜脈采集血樣,分別進(jìn)行血液學(xué)和血清生化指標(biāo)的檢測(cè)。

2.2.2.1 血液學(xué)檢測(cè) 5 mL 血樣,1%肝素抗凝,SYSMEX 血液分析儀進(jìn)行血液學(xué)常規(guī)檢測(cè)。 檢測(cè)的血液學(xué)指標(biāo)：白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、嗜中酸性粒細(xì)胞數(shù)、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度百分比和紅細(xì)胞分布標(biāo)準(zhǔn)差百分比[6-9]。

2.2.2.2 血清生化學(xué)檢測(cè) 5 mL 血液凝固后吸取血清樣品,OLYMPUS AU 2700 全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清生化學(xué)檢測(cè)。 檢測(cè)的血清生化指標(biāo)：鉀離子、鈉離子、氯離子、氯化鈣、葡萄糖、白蛋白、總蛋白、球蛋白、尿素氮、肌酐、甘油三酯、總膽固醇含量,丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫谷草轉(zhuǎn)氨酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)活性[6-7]。

2.2.3 病理學(xué)檢查 給藥結(jié)束后24 小時(shí)內(nèi)宰殺對(duì)照組及高劑量組的試驗(yàn)牛和試驗(yàn)中所有死亡的牛,及時(shí)進(jìn)行病理剖檢和注射部位的眼觀檢查,觀察組織器官的病理變化。 并采集肝臟,腎臟,心臟,脾臟,肺臟、胸腺,淋巴結(jié)、十二指腸等組織器官,進(jìn)行常規(guī)檢查后,10%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟切片,H. E. 染色,光鏡觀察病理組織學(xué)變化。 與對(duì)照組比較,如果5 倍劑量處理組未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的組織病理學(xué)變化,則較低劑量處理組就不再進(jìn)行組織病理學(xué)檢查[8]。

2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 應(yīng)用軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)。 采用t 檢驗(yàn)比較試驗(yàn)組與對(duì)照組間均增重、血液學(xué)和血清生化學(xué)等各項(xiàng)指標(biāo)的顯著性差異[10]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 臨床觀察 整個(gè)試驗(yàn)期過(guò)程中受試牛全部存活。 對(duì)照組、推薦劑量組和3 倍推薦劑量組的所有試驗(yàn)牛的健康狀況良好,精神狀態(tài)、飲水和采食量均正常,無(wú)中毒癥狀,未觀察到任何臨床病理癥狀;注射部位一過(guò)性腫脹、發(fā)熱、疼痛,劑量依賴性硬度增加現(xiàn)象,到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)注射部位恢復(fù)良好。 5 倍劑量組中有個(gè)別牛在每次注射給藥后表現(xiàn)出不適癥狀,表現(xiàn)為不愿站立、坐臥不起、數(shù)分鐘后有所緩解;注射部位腫脹、硬度增加、皮膚增厚、觸診敏感,到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仍有3 頭牛觀察到注射部位的稍許腫脹。

試驗(yàn)期間各劑量組牛的體溫、心率和呼吸頻率變化相對(duì)恒定,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均無(wú)顯著性差異。

3.2 增重與消耗飼料量 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組試驗(yàn)牛平均增重和平均消耗飼料量的結(jié)果見(jiàn)表2。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明,推薦劑量組平均增重略有提高,但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P ＞0.05);3 倍和5 倍推薦劑量組平均增重雖略有下降,但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)和(P ＞0.05)。 與對(duì)照組相比,推薦劑量組的平均消耗飼料量變化不明顯;試驗(yàn)期間的1 d 到5 d 內(nèi),3 倍推薦劑量組的平均消耗飼料量在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)上呈現(xiàn)下降趨勢(shì),5 倍推薦劑量組的平均消耗飼料量明顯降低,與對(duì)照組和推薦劑量組之間差異顯著(P ＜0.05);試驗(yàn)開(kāi)始的7 d 后,3 倍和5 倍推薦劑量組的平均消耗飼料量恢復(fù)正常且少許增加。 此外,整個(gè)試驗(yàn)期間,與推薦劑量組相比,3倍和5 倍推薦劑量組的平均消耗飼料量下降。

表2 加米霉素注射液對(duì)牛生長(zhǎng)性能的影響 (ˉx±SD,n= 6)

3.3 血液學(xué)指標(biāo)分析 血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3 ～5。與對(duì)照組相比,加米霉素處理組第5 天和第10天的血小板計(jì)數(shù)增加顯著(P ＜0.05)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加顯著(P ＜0.05),并且隨用藥劑量的增加指標(biāo)數(shù)值有增加趨勢(shì),顯著差異越明顯;加米霉素處理組中除白細(xì)胞計(jì)數(shù)均偏離正常參考范圍,其他血液學(xué)指標(biāo)：紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞平均體積、紅細(xì)胞分布寬度百分比和紅細(xì)胞分布標(biāo)準(zhǔn)差百分比均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05);推薦劑量組紅細(xì)胞參數(shù)保持在正常范圍內(nèi),3 倍和5 倍推薦劑量組中,一些動(dòng)物的紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白稍偏離參考范圍;我們認(rèn)為血液學(xué)指標(biāo)的變化是注射部位炎癥反應(yīng)和少量出血淤血所引起的繼發(fā)癥狀。

表3 給藥前(第0 天)牛血液學(xué)指標(biāo) (ˉx±SD,n=6)

表4 給藥后(第5 天)加米霉素注射液對(duì)牛血液學(xué)指標(biāo)的影響 (ˉx±SD,n= 6)

表5 給藥后(第10 天)加米霉素注射液對(duì)牛血液學(xué)指標(biāo)的影響 (ˉx±SD,n= 6)

3.4 血清生化指標(biāo)分析 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6 ～8。 與對(duì)照組相比,所有加米霉素處理組,血清生化指標(biāo)：鈉離子、氯離子、葡萄糖、白蛋白、總蛋白、球蛋白、甘油三酯、總膽固醇等均無(wú)顯著變化,能夠觀察到不呈劑量關(guān)系的3 倍和5 倍推薦劑量組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和尿素氮下降,我們認(rèn)為這是繼發(fā)于腎臟和肝臟的少量出血、淤血。

3.5 組織病理學(xué)檢查 試驗(yàn)結(jié)束后將所有試驗(yàn)牛

表6 給藥前(第0 天)牛血清生化指標(biāo) (ˉx±SD,n= 6)

血液生化參數(shù) 空白對(duì)照組 推薦劑量組(6 mg/kg·bw)3 倍推薦劑量組(18 mg/kg·bw)5 倍推薦劑量組(30 mg/kg·bw)K +(mmol/l) 4.667 ±0.551 4.833 ±0.322 4.933 ±0.379 5.467 ±0.351 CaCl(mmol/l) 2.733 ±0.127 2.73 ±0.135 2.703 ±0.085 2.613 ±0.060尿素氮(mmol/l) 3.733 ±0.416 2.967 ±0.902 2.833 ±0.569 2.633 ±0.777肌酐(umol/l) 83 ±3.606 83 ±5.292 70 ±4.583 84.667 ±16.563丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L) 30.33 ±2.517 27.67 ±5.508 30.67 ±5.686 29.33 ±7.234天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U/L) 66.33 ±4.041 70 ±4.583 71 ±4.583 73 ±12.767乳酸脫氫酶(U/L) 1 079 ±80.299 1 166.67 ±54.519 1 209 ±122.65 1 200.67 ±104.223堿性磷酸酶(U/L) 227.67 ±61.598 177.67 ±74.769 155 ±32.97 164.33 ±13.317

表7 給藥后(第5 天)加米霉素注射液對(duì)牛血清生化指標(biāo)的影響 (ˉx±SD,n= 6)進(jìn)行剖檢,與空白對(duì)照組相比,推薦劑量組和3 倍推薦劑量組的注射部位有炎癥反應(yīng)包括：皮膚、皮下組織增厚,靠近皮下注射部位的肌肉輕度變色,注射部位發(fā)紅,隨著劑量的增加,炎癥癥狀有所嚴(yán)重,推薦劑量組的動(dòng)物此類癥狀較輕,給藥11 d 后組織增厚和肌肉變色有所緩解,注射部位紅色也逐漸消退。 5 倍推薦劑量組的注射部位肌肉剖檢有變性癥狀,結(jié)締組織增生,組織纖維化,面積在6 cm2左右,給藥11 d 后增厚腫脹的組織未完全消退。

各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、皺胃、十二指腸、胸腺)大小、色澤正常,未觀察到與藥物相關(guān)的眼觀病理變化。 空白對(duì)照組和5 倍推薦劑量組采集樣品進(jìn)行組織學(xué)檢查,顯微檢查發(fā)現(xiàn)：所有試驗(yàn)牛的臟器(心、肝、脾、肺、腎、皺胃、腸、胸腺)均未發(fā)現(xiàn)明顯的病理組織學(xué)變化,僅肺部有輕度淤血,5 倍推薦劑量組的注射部位組織切片有輕微炎癥。

表8 給藥后(第10 天)加米霉素注射液對(duì)牛血清生化指標(biāo)的影響 (ˉx±SD,n= 6)

4 討論

靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)是新獸藥臨床試驗(yàn)研究的重要內(nèi)容,主要用于研究受試藥物在治療范圍或治療范圍以上劑量時(shí)對(duì)生理功能潛在的不良影響。通過(guò)此研究,可為臨床研究和安全用藥提供科學(xué)的依據(jù),也可為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新的適應(yīng)癥提供參考[11]。

本試驗(yàn)從一般臨床癥狀、體溫、心率、呼吸等臨床變化、增重與消耗飼料量分析、血液學(xué)指標(biāo)分析、血清生化指標(biāo)分析、組織病理學(xué)檢查等多方面,對(duì)以加米霉素注射液的推薦劑量、3 倍推薦劑量、5 倍推薦劑量頸部皮下注射的受試牛進(jìn)行安全性研究和評(píng)估。 從試驗(yàn)結(jié)果可以看出,使用推薦劑量和3倍推薦劑量的加米霉素注射液,整個(gè)試驗(yàn)期間受試牛精神狀態(tài)、飲水、采食和糞便等均未出現(xiàn)異常,體溫、心率、呼吸頻率、增重和消耗飼料量等與空白對(duì)照均無(wú)顯著性變化,雖然部分試驗(yàn)牛的血液學(xué)和血清生化指標(biāo)有不同程度的變化,但剖檢均未發(fā)現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)變化,注射部位炎癥隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸消退。 由此可以說(shuō)明,加米霉素注射液按照推薦劑量應(yīng)用于牛是安全的。

需要注意的是,使用5 倍推薦劑量加米霉素注射液后,個(gè)別受試牛出現(xiàn)不適臨床癥狀,平均飼料消耗量與對(duì)照組相比顯著下降(P ＜0.05),血液學(xué)和血清生化指標(biāo)個(gè)別與對(duì)照組有顯著性差異,剖檢發(fā)現(xiàn)肺部輕度淤血,注射部位肌肉顯示有變性、結(jié)締組織增生、組織纖維化且伴有炎癥,表明,5 倍推薦劑量給藥對(duì)牛有一定的藥物反應(yīng)。 同其他大環(huán)內(nèi)脂類抗生素一樣,加米霉素注射液最常見(jiàn)的副作用是引起機(jī)體注射部位腫脹[4-5、12]。

血液生理指標(biāo)及血清生化指標(biāo)方面,與劑量相關(guān)的血小板計(jì)數(shù)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加,我們認(rèn)為這些改變是繼發(fā)于注射部位局部炎癥過(guò)程[13-15]。 同時(shí)也能觀察到一些不呈劑量關(guān)系的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐下降,但病理組織學(xué)檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)受試牛的肝臟和腎臟有明顯的病理學(xué)損傷,因此,還不能判斷為受試牛這些指標(biāo)的下降一定與使用加米霉素注射液有關(guān)。

5 結(jié)論

中牧股份有限公司研制的加米霉素注射液,含量規(guī)格為150 mL 含15 g(15%),按推薦劑量給藥(6 mg/kg·bw)具有較好的安全性。