三氮脒與含苯磺酰胺結(jié)構(gòu)單元的新型三氮脒衍生物對小鼠急性毒性試驗

馬維武, 李學強, 周學章

(1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室, 寧夏 銀川750021 2.寧夏大學化學化工學院, 寧夏 銀川750021)

三氮脒(Diminazene)是一種廣譜抗原蟲藥物,也是目前用于治療家畜錐蟲病的主要藥物,三氮脒對寄生蟲的毒性主要由通過蟲體細胞質(zhì)膜的攝取決定,取決于寄生蟲對細胞表面轉(zhuǎn)運蛋白的有效表達[1]。 然而,三氮脒作為一種合成藥物,在治療家畜血液寄生蟲病時也表現(xiàn)出其毒性大、安全范圍小等缺點。 根據(jù)現(xiàn)有報道,三氮脒引起中毒的動物主要有牛、馬、駱駝、犬[2-5]。 關(guān)于降低三氮脒毒性作用的研究已報道的有中國人民解放軍軍需大學預(yù)防獸醫(yī)學教研室和德國Bourdichon 博士分別研制的三氮脒脂質(zhì)體和復方三氮脒注射液[6],通過改造三氮脒的化學結(jié)構(gòu)以期降低其毒性的研究目前還沒有報道。 磺酰胺類化合物在醫(yī)藥方面具有廣泛的生物活性,尤其在抗寄生蟲方面應(yīng)用效果顯著,該類化合物對寄生蟲的抑制率可達99%,且對動物脾臟和肝臟的副作用較小[8]。 因此,本試驗化學合成了含苯磺酰胺結(jié)構(gòu)單元的三氮脒衍生物,通過急性毒性試驗測定了三氮脒及其衍生物在不同給藥方式下對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)及95%的可信限,并通過對死亡小鼠進行剖檢觀察確定其毒性作用主要靶器官,以期為臨床用藥和后續(xù)的研究以及新藥開發(fā)提供可靠的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物注射用三氮脒,購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所;含苯磺酰胺結(jié)構(gòu)單元的新型三氮脒衍生物由寧夏大學化工學院合成,分析純,臨用前配制成3.0%的滅菌溶液。 三氮脒的滅菌粉末按干燥品計算,含三氮脒(C14H15N7·2C4H7N03)不得少于97.5%,按平均裝量計算,含三氮瞇(C14H15N7·2C4H7N03)應(yīng)為標示量的95.0% ～105.0%。 三氮脒與苯磺酰氯反應(yīng)生成含苯磺酰胺結(jié)構(gòu)單元的新型三氮脒衍生物(C20H20N7SO2·2C4H7N03),反應(yīng)方程式如下：

1.1.2 實驗動物 SPF 級昆明系小鼠,雌雄各半,健康適齡,體重18 ～22 克,購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.3 試驗器材與溶劑 二甲基亞砜,1 mL 注射器及針頭,記號筆,電子天平( FA2004N,上海精密科學儀器有限公司),鼠籠。

1.2 試驗方法 按照改良寇氏法進行試驗,選擇腹腔注射和皮下注射兩種給藥方式。 由于三氮脒溶于水,但其衍生物在水中的溶解性并不是很好,故本試驗選擇二甲基亞砜(DMSO)作溶媒,用20%二甲基亞砜生理鹽水溶液溶解三氮脒及其衍生物。

1.2.1 預(yù)試驗 取80 只小鼠試驗,雌雄各半,根據(jù)體重隨機分為16 組,每組5 只,禁食12 h 但不禁水,三氮脒組和衍生物組各用8 組小鼠。 將三氮脒組和衍生物組分別按0(20% DMSO 對照組)、120、180、240、300、360、420、480 mg/kg 等差劑量給小鼠腹腔注射。 之后同樣取80 只小鼠試驗,分組同前。將兩組藥物分別按0(20% DMSO 對照組)、120、180、240、300、360、420、480 mg/kg 等差劑量給小鼠皮下注射。 注射時采用等濃度稀釋法,先稱量每只小鼠的體重(g),再根據(jù)給藥體積(0.1 mL/10 g)計算出小鼠的給藥量。 給藥當天密切觀察小鼠出現(xiàn)的毒性癥狀,然后每天觀察2 次以上,詳細記錄小鼠出現(xiàn)毒性反應(yīng)的時間以及小鼠死亡時間、死亡情況、中毒癥狀等。 連續(xù)觀察7 d 并記錄觀察結(jié)果,對死亡的小鼠立即進行剖檢,未死亡的小鼠觀察7 d后處死并進行剖檢,取心、脾、肝、肺、腎,來觀察病理改變情況[9]。 分別找出不同給藥途徑下兩種藥物對小鼠的LD100值(100%死亡率)和LD0值(0%死亡率)。

1.2.2 正式試驗 對于預(yù)試驗測得LD100值和LD0值的試驗組,根據(jù)預(yù)試驗得到的LD100值和LD0值,代入毒理學計算公式[9]計算出相鄰兩組劑量的組距(i) i=(lg LD100-lg LD0)/(n-1),根據(jù)i 值計算出相鄰兩組劑量的公比(R)R = lg -1i,根據(jù)公比(R)計算好各組劑量后進行試驗。

各試驗組都按照以下步驟進行試驗,取60 只小鼠(雌雄各半),將小鼠根據(jù)體重隨機分為6 小組,每小組10 只小鼠,禁食12 h 但不禁水。 按照計算好的每組劑量給小鼠注射,其中設(shè)對照組1 組(20% DMSO),具體試驗操作與預(yù)試驗相同。

1.2.3 指標觀察 給藥后即刻按照一般觀察項目指征指導原則[10]觀察動物,觀察的指標包括：呼吸、活動、食欲、糞便、皮膚、毛發(fā)、眼、鼻、口腔分泌物等。 連續(xù)觀察7 d,詳細記錄下小鼠死亡情況和中毒反應(yīng)。 對死亡的小鼠立即進行剖檢,對主要臟器進行肉眼觀察,明確藥物對小鼠毒性作用的靶器官。

1.2.4 統(tǒng)計方法 統(tǒng)計各劑量組小鼠死亡數(shù),計算出死亡率(P),按改良寇氏公式[11-12]LD50= lg-1[Xm-i(∑P-0.5)]計算LD50值,式中Xm 為最大劑量組劑量對數(shù)值;i 相鄰兩組對數(shù)劑量的差值;P 為各組動物死亡率,用小數(shù)表示;∑P為各組動物死亡率之總和。 lg LD50的標準誤按公式：SX50=i[(∑p- ∑p2)/(n-1)]1/2計算,式中n 為每組動物數(shù)。 LD50的95% 可信限按公式lg-1( X50±1.96SX50)計算,X50= lg LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗結(jié)果 預(yù)試驗中三氮脒腹腔注射組和三氮脒皮下注射組、衍生物腹腔注射組得到LD100值和LD0值均為480 mg/kg·bw 和120 mg/kg·bw,皮下注射衍生物組因受藥物濃度及小鼠最大給藥容積的影響,未得出其對小鼠的100%致死量,故無法計算出其對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)及95%可信限,但根據(jù)試驗結(jié)果可知,衍生物皮下注射組的LD50＞500.0 mg/kg·bw。 (結(jié)果見表1)但這也說明衍生物皮下注射時較三氮脒毒性小,也較衍生物腹腔注射時毒性要小,初步實現(xiàn)了比較研究這兩種藥物毒性的試驗?zāi)康摹?所以對找到LD100值和LD0值的三組試驗進一步進行正式試驗以測定藥物的LD50值及其95%的可信限。

表1 預(yù)試驗結(jié)果 (mg/kg·bw、只)

2.2 正式試驗結(jié)果

2.2.1 各試驗組小鼠毒性反應(yīng) 三氮脒腹腔注射時,低劑量組10 min 后出現(xiàn)間歇性的抽搐、靜臥、閉眼等反應(yīng);30 min 后表現(xiàn)閉眼、抱團、怠動;24 h 后均恢復正常,剖檢發(fā)現(xiàn)肺部有病變。 高劑量組10 min 后出現(xiàn)呼吸緩慢、行動遲緩、靜臥、腹瀉等癥狀;30 min 后表現(xiàn)出呼吸緩慢、行動遲緩、靜臥、腹瀉等癥狀,為死亡高峰。 小鼠死亡時間集中在30 min ～1 h 之內(nèi),剖檢中毒死亡小鼠,可見部分小鼠肺部出現(xiàn)淤血、出血點明顯,肝臟呈土黃色,結(jié)果見圖1。

三氮脒皮下注射時,低劑量組10 min 后出現(xiàn)安靜怠動、精神萎靡等反應(yīng);30 min 后表現(xiàn)為靜臥、后肢無力、張開、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象;24 h 后未出現(xiàn)死亡而且均恢復正常,只是行動還較緩慢,剖檢發(fā)現(xiàn)肺部淤血,肝臟呈土黃色。 高劑量組10 min 后出現(xiàn)走路不穩(wěn)、閉眼昏睡、反應(yīng)遲鈍、打顫等癥狀;30 min 后表現(xiàn)為精神萎靡、四肢無力、出現(xiàn)輕微抽搐;5 h 后開始出現(xiàn)死亡,至24 h 已死亡多數(shù),死亡集中在46 h 之內(nèi),最快在5 h 時死亡。 剖檢中毒死亡小鼠,可見部分小鼠肝臟呈土黃色,肺部淤血、出血點明顯,結(jié)果見圖2。

衍生物腹腔注射時,低劑量組10 min 后出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩的反應(yīng);30 min 后表現(xiàn)為閉眼、抱團、呼吸急促、反應(yīng)遲鈍;24 h 后均恢復正常,剖檢發(fā)現(xiàn)肺部有病變。 高劑量組10 min 后出現(xiàn)呼吸困難、走路不穩(wěn)、尾部發(fā)黑、平躺閉眼等癥狀;30 min 后出現(xiàn)四肢抽搐死亡情況;24 h 后多數(shù)死亡,活著的表現(xiàn)為四肢無力、走路不穩(wěn)、打顫,死亡集中在48 h 之內(nèi),最快在30 min 時死亡。 剖檢中毒死亡小鼠,可見部分小鼠肺部出現(xiàn)黑點,肝臟呈土黃色,結(jié)果見圖3。

衍生物皮下注射時,低劑量組10 min 后表現(xiàn)為安靜怠動,呼吸怠慢,30 min 后表現(xiàn)為靜臥,后肢無力張開等癥狀;24 h 后未出現(xiàn)死亡,中毒反應(yīng)逐漸減弱,剖檢發(fā)現(xiàn)肺部淤血,肝臟呈土黃色。 高劑量組10 min 后表現(xiàn)出呼吸困難,煩躁不安,不斷撓后背等癥狀;30 min 后出現(xiàn)走路不穩(wěn),昏睡,反應(yīng)遲鈍;24 h 后行動較緩慢但有進食進水且未出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。 剖檢發(fā)現(xiàn)病理變化主要表現(xiàn)為肺部淤血,有明顯出血點,肝臟呈土黃色,結(jié)果見圖4。

對照組注射20% DMSO10 min 后表現(xiàn)為精神萎靡,30 min 后即恢復,正常進食進水,之后未見死亡。 剖檢結(jié)果見圖5,正常小鼠見圖6。

圖1 三氮脒腹腔注射小鼠剖檢變化

圖2 三氮脒皮下注射小鼠剖檢變化

圖3 衍生物腹腔注射小鼠剖檢變化

圖4 衍生物皮下注射小鼠剖檢變化

圖5 對照組小鼠剖檢變化

圖6 正常小鼠剖檢變化

2.2.2 各試驗組小鼠死亡情況 各試驗組小鼠死亡的結(jié)果分別見表2、3、4。

2.3 各試驗組LD50計算結(jié)果 三氮脒腹腔注射組：根據(jù)正式試驗各組記錄到的腹腔注射三氮脒后死亡情況(見表2),通過計算得出腹腔注射三氮脒的LD50為235.0 mg/kg·bw,SX50=0.0894,LD50的95%可信限為157.0 ～351.7 mg/kg·bw。 三氮脒皮下注射組：根據(jù)正式試驗各組記錄到的皮下注射三氮脒后死亡情況(見表3),通過計算得出皮下注射三氮脒的LD50為257.6 mg/kg·bw,SX50=0.0906,LD50的95%可信限為171.2 ～387.8 mg/kg·bw。 衍生物腹腔注射組：根據(jù)正式試驗各組記錄到的腹腔注射衍生物后死亡情況(見表4),通過計算得出腹腔注射衍生物LD50為251.8 mg/kg·bw,SX50=0.0889,LD50的95%可信限為168.6 ～376.0 mg/kg·bw。 衍生物皮下注射組：LD50＞500.0 mg/kg·bw。

表2 三氮脒腹腔注射組小鼠急性毒性試驗結(jié)果

表3 三氮脒皮下注射組小鼠急性毒性試驗結(jié)果

表4 衍生物腹腔注射組小鼠急性毒性試驗結(jié)果

3 討論

臨床前安全評價是新藥進入臨床試驗前必經(jīng)的安全性試驗階段,根據(jù)已有的化學類藥物臨床前安全評價指導原則,多以急性毒性(Acute toxicity)為開端[13]。 急性毒性試驗是評價單次或24 h 內(nèi)多次累積給藥后動物表現(xiàn)出的毒性反應(yīng)。 LD50是藥物的重要特征性參數(shù)之一,是藥物的安全標尺,它是一個經(jīng)過統(tǒng)計學處理計算得出的數(shù)值,通常以有毒物質(zhì)質(zhì)量與試驗生物體質(zhì)量的比值表示,其數(shù)值越大藥物越安全[14]。 由于給藥途徑不同,受試動物的吸收速度、吸收率和暴露量會有所不同,因此需要采用不同給藥途徑進行急性毒性試驗。 此外,通過對不同途徑給藥所得結(jié)果進行比較,可以獲得一些初步的生物利用度信息[10]。 通常,給藥途徑必須有一種與臨床擬用途徑相同,臨床上雖然不用腹腔注射,但動物試驗因腹腔注射給藥吸收能力強,補液時間短、速度快等優(yōu)點,頗為常用。 所以本試驗選擇腹腔注射和皮下注射這兩種給藥途徑。

本試驗通過小鼠急性毒性試驗測得腹腔注射三氮脒及其衍生物對小鼠的LD50分別為235. 0 mg/kg·bw、251. 8 mg/kg·bw,按毒性分級標準都屬于中等毒藥物[11],其衍生物的毒性較三氮脒下降了7. 15%;皮下注射三氮脒對小鼠的LD50為257. 6 mg/kg·bw,按毒性分級標準屬于中等毒藥物, 其衍生物對小鼠的LD50＞500. 0 mg/kg·bw,按毒性分級標準屬于低毒藥物,兩者差異顯著。 從試驗結(jié)果可知,對于三氮脒及其衍生物而言,皮下注射方式要比腹腔注射毒性作用小,這與沈建忠《動物毒理學》[15]中同一化合物以不同的途徑染毒,其毒性大小腹腔注射＞皮下注射是一致的;同時,通過試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射和皮下注射兩種給藥方式下,此三氮脒衍生物的毒性作用都要比三氮脒小。 說明此衍生物明顯降低了三氮脒的毒性作用,對其研發(fā)具有很好的前景。

通過兩種不同的給藥途徑可以看出,腹腔和皮下注射三氮脒及其衍生物的中毒癥狀相似,均出現(xiàn)精神沉郁、走路不穩(wěn)、抽搐打顫、呼吸急促等臨床表現(xiàn)和肺臟淤血,肝臟呈土黃色的病理剖檢變化。 上述結(jié)果表明,三氮脒及其衍生物急性毒性的主要靶器官為肺臟和肝臟,這與之前報道的三氮脒引起中毒的動物病理剖檢變化基本一致[2-5]。

本次試驗嚴格按照毒理學的標準進行測定,測定方法科學,結(jié)果真實可靠,將為今后進行三氮脒及其衍生物的長期毒性試驗、致突變試驗等試驗設(shè)計提供劑量選擇依據(jù)和有關(guān)毒性信息,進一步豐富了三氮脒及其衍生物的毒理學資料,對于研究和評價其毒性具有重要意義,同時也為今后三氮脒及其衍生物的藥理研究提供了試驗基礎(chǔ)。