豬瘟和豬藍(lán)耳病混合感染的診斷與防控

牛緒東 ，馮學(xué)俊 ，任 禾 ，馬洪超 ，張?jiān)?，劉建柱 *，，

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018；2.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100125；3.山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271018；4.山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018）

豬瘟（CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、熱性、高度傳染性疾病[1]，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定通報(bào)的疫?。回i繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又名豬藍(lán)耳病，是動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種繁殖障礙和呼吸道癥狀的疾病，是OIE規(guī)定通報(bào)的疫病，我國(guó)規(guī)定為二類動(dòng)物疫病[2]。近年來(lái)，豬群中豬病多以2種或2種以上的病原微生物共同作用，引起嚴(yán)重的混合感染，簡(jiǎn)稱混感。豬病的復(fù)雜性給豬場(chǎng)疾病的診斷和防治工作帶來(lái)較大困難。作者于2017年5月30日在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保健醫(yī)院接診了一例來(lái)自山東省泰安市侯某某帶來(lái)的4頭病死豬，經(jīng)臨床初步診斷和實(shí)驗(yàn)室RT-PCR和PCR技術(shù)檢測(cè)，確診其為豬瘟病毒和豬藍(lán)耳病病毒混合感染?，F(xiàn)將該病例的診斷情況總結(jié)如下：

1 發(fā)病情況

經(jīng)詢問(wèn)畜主得知，該豬場(chǎng)是在原來(lái)廢棄6年多的舊豬場(chǎng)場(chǎng)址上幾乎是重新建設(shè)的新豬場(chǎng)。畜主于5月16日從山東某大型種豬場(chǎng)購(gòu)來(lái)第1批1000頭（23～30日齡）剛斷奶的仔豬，5 d后仔豬開(kāi)始出現(xiàn)咳嗽、腹瀉，個(gè)別出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，種豬場(chǎng)技術(shù)人員診斷為腸炎和鏈球菌病，讓畜主立即在飼料內(nèi)拌入氟苯尼考和多西環(huán)素治療5 d，投藥后未見(jiàn)明顯效果，仍繼續(xù)發(fā)病并開(kāi)始出現(xiàn)死亡。隨后又在飼料內(nèi)拌入硫酸黏菌素和硫酸新霉素治療4 d，仍未見(jiàn)效果。此時(shí)，發(fā)病率和死亡率明顯增加，畜主見(jiàn)病情嚴(yán)重，遂來(lái)本醫(yī)院進(jìn)行診治。據(jù)悉，購(gòu)進(jìn)仔豬已兩周，大約有三分之一的仔豬發(fā)病，并已死亡70余頭。

畜主購(gòu)進(jìn)的這批仔豬是與這家種豬場(chǎng)所在的某集團(tuán)總公司簽訂了供銷合同，當(dāng)確診有豬瘟后，畜主于6月1日自行緊急免疫了兩欄相對(duì)健康的89頭仔豬，一周內(nèi)僅死亡3頭，其余86頭仔豬經(jīng)喂服多西環(huán)素和維生素C4d后基本正常。場(chǎng)內(nèi)還有接近800多頭仔豬，一周內(nèi)又死亡300余頭，由于種豬場(chǎng)所在集團(tuán)總公司內(nèi)部的未知原因，直到6月8日才對(duì)剩余的其中400余頭仔豬進(jìn)行了豬瘟細(xì)胞苗免疫注射。6月16日回訪，大約僅存活不到200頭，該批仔豬購(gòu)進(jìn)一個(gè)月其死亡率就高達(dá)80%以上，損失慘重。

2　臨床癥狀

病仔豬呆立，精神沉郁，喜臥扎堆，采食量減少或廢絕；體溫多在40.8～41.6 ℃之間；結(jié)膜潮紅，眼瞼水腫（見(jiàn)圖1）；輕微咳嗽且氣喘；多數(shù)排出稀軟糞便（見(jiàn)圖2），有的排帶有黏液的干糞（見(jiàn)圖3）；皮膚可見(jiàn)點(diǎn)狀出血，有的局部皮膚呈現(xiàn)紫紅色，特別是耳廓、頸部和后軀等部位（見(jiàn)圖4）；站立不穩(wěn)，行走搖擺，瀕臨死亡的病豬出現(xiàn)肌肉震顫、角弓反張現(xiàn)象；病仔豬很快脫水、貧血、消瘦，最后衰竭死亡。

3　病理剖檢

尸體貧血、消瘦、脫水（見(jiàn)圖5）。全身淋巴結(jié)腫大，周邊出血其切面呈“大理石樣”花紋（見(jiàn)圖6、圖7）。心包積有少量淡黃色液體（見(jiàn)圖8），心內(nèi)、外膜均出血（見(jiàn)圖9），左心耳嚴(yán)重出血（見(jiàn)圖10）。肝臟輕度腫大、淤血、出血。脾臟腫大，邊緣有出血性梗死灶（見(jiàn)圖11）。肺臟淤血、出血，在尖葉、心葉、膈葉前下部和副葉呈現(xiàn)“肉樣”實(shí)變（見(jiàn)圖12）。腎臟輕度腫大，其被膜下可見(jiàn)多量針尖狀出血點(diǎn)，腎乳頭明顯出血，輸尿管擴(kuò)張（見(jiàn)圖13）。胃底黏膜潮紅、出血，可見(jiàn)少量小的出血性潰瘍（見(jiàn)圖14）；小腸壁變薄，其內(nèi)容物為黃色稀薄液體（見(jiàn)圖15）；結(jié)腸圓錐腸系膜輕度水腫，通過(guò)漿膜可看到許多白色壞死灶（見(jiàn)圖16），其黏膜彌漫性出血（見(jiàn)圖17）。

4　實(shí)驗(yàn)室診斷

分別采取病死豬的淋巴結(jié)、肝臟、肺臟和脾臟，以備病料中4種病毒基因組的提取。

對(duì)豬瘟病毒（C SFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV），按照RNA提取試劑盒（購(gòu)自上海生工生物公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)診斷。這3種病毒的特異性引物均由北京偉嘉集團(tuán)山東檢測(cè)中心提供。擴(kuò)增片段大小分別為272 bp、511 bp、528 bp，產(chǎn)物通過(guò)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，在該病料中CSFV核酸和PRRSV核酸均出現(xiàn)目的條帶（見(jiàn)圖18），說(shuō)明病料中兩病毒陽(yáng)性。而TGEV核酸未出現(xiàn)目的條帶即該病毒陰性。

對(duì)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）進(jìn)行PCR檢測(cè)法診斷。按照DNA提取試劑盒（購(gòu)自上海生工生物公司）說(shuō)明書(shū)，對(duì)采取的病料進(jìn)行DNA提取。根據(jù)董亞清等[3]報(bào)道設(shè)計(jì)PCV2引物序列，上游引物序列：5’-CGTTGGAATGGTACTCCTC-3’；下游引物序 列：5'-TATGGAAATTCAGGGCATG-3'。目的片段大小515 bp。采用25μL PCR體系：DNA樣本1μL；2×Taq master Mix12.5μL；上 下 游引物各0.5μL；滅菌ddH2O 11.5μL。PCR 程 序：95 ℃5min；95 ℃30s、48 ℃25s、72 ℃30s，32個(gè) 循 環(huán)；72 ℃10min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，該病料中PCV2核酸沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶（見(jiàn)圖18），說(shuō)明病料中PCV2陰性。

5　結(jié)論

根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和病理剖檢，初步診斷為CSFV、PCV和PRRSV的混合感染性疾病。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室RT-PCR和PCR檢測(cè)得知，CSFV和PRRSV為陽(yáng)性，PCV為陰性。因多數(shù)仔豬腹瀉，又通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)了TGEV，結(jié)果為陰性。經(jīng)以上檢測(cè)及綜合分析，該病例最后確診為CSFV和PRRSV的混合感染。

6　討論與小結(jié)

6.1 發(fā)病原因簡(jiǎn)析

1)據(jù)曹劍等研究表明[4]，豬瘟母源抗體與母豬體內(nèi)的豬瘟抗體水平基本呈正相關(guān)。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查得知，該發(fā)病仔豬購(gòu)自的種豬場(chǎng)由于人員更替造成管理混亂，免疫工作未按免疫程序做到位，可能出現(xiàn)免疫拖延及漏免現(xiàn)象，加之免疫監(jiān)測(cè)缺失，這樣就造成了母體內(nèi)CSF的特異性抗體下降，累及哺乳仔豬從初乳中獲得的母源抗體維持時(shí)間縮短，使之21日齡斷奶后很快出現(xiàn)疫病。

2)據(jù)杜善忠等研究表明[5]，豬瘟母源抗體從28日齡開(kāi)始下降加劇，半衰期為17 d左右；豬藍(lán)耳病母源抗體21日齡開(kāi)始下降加劇，半衰期9 d左右。該病例中的仔豬開(kāi)始發(fā)病的日齡（28～35日齡）符合此研究中兩種疫病母源抗體下降的規(guī)律。

3)PRRS V屬于免疫抑制性病原，一旦感染就會(huì)造成機(jī)體免疫力降低[6]，從而影響豬瘟疫苗的免疫效果，容易誘發(fā)CSFV等病原微生物的感染。

4)由于21日齡的早期斷奶應(yīng)激和長(zhǎng)途運(yùn)輸及環(huán)境突變應(yīng)激，使斷奶仔豬的免疫力及母源抗體降低，從而誘發(fā)多種疫病[7]。

圖1　眼瞼水腫

圖2　排出稀軟糞便并污染后軀

圖3　排干糞球并附有黏液

圖4　仔豬扎堆，耳廓呈藍(lán)紫色

圖5　尸體貧血、消瘦、脫水

圖6　右下頜淋巴結(jié)腫大，出血呈大理石樣花紋

圖7　左膝前淋巴結(jié)髓樣腫大、周邊出血

圖8　心包積有少量淡黃色液體

圖9　心內(nèi)膜出血

圖10　心外膜出血，左心耳嚴(yán)重出血

6.2 本次病例高死亡率的原因簡(jiǎn)析

1)復(fù)雜的多病因混合感染。本次病例在CSFV和PRRSV協(xié)同作用下，很快便引起了斷奶仔豬嚴(yán)重的發(fā)病和死亡。

圖11　脾臟腫大且邊緣有出血性梗死灶

圖12　肺尖葉、心葉、膈葉前下部和副葉呈“肉樣”實(shí)變

圖13　腎臟腫大其被膜下有針尖狀出血點(diǎn)，腎乳頭明顯出血

圖14　胃底黏膜潮紅且有小的出血性潰瘍

圖15　小腸內(nèi)容物為黃色稀薄液體

圖16　結(jié)腸系膜輕度水腫，通過(guò)漿膜可見(jiàn)白色壞死灶

圖17　大結(jié)腸黏膜彌漫性出血，也可看到白色壞死點(diǎn)

圖18　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2)確診不及時(shí)。畜主在仔豬群發(fā)病初期沒(méi)有到權(quán)威獸醫(yī)診療機(jī)構(gòu)去診斷，自行治療十余天無(wú)效且越來(lái)越嚴(yán)重，才決定來(lái)本醫(yī)院進(jìn)行診斷，作者于2 d內(nèi)給予確診。

3)緊急免疫不到位。該病例在本醫(yī)院確診后，畜主與種豬場(chǎng)技術(shù)人員對(duì)提出的緊急免疫方案不知何原因遲遲不去執(zhí)行，又拖延一周之后才進(jìn)行了半數(shù)豬只的豬瘟細(xì)胞苗的緊急免疫注射。此時(shí)其感染率、發(fā)病率和死亡率猛增，作者認(rèn)為已為時(shí)已晚。

4)幼小仔豬免疫力不健全。特別是早期斷奶的仔豬抗病力更差，更需要畜主做好生物安全工作，并精心飼養(yǎng)與管理。幼小仔豬一旦發(fā)生疫病，如果防治不及時(shí)則后果非常嚴(yán)重。

6.3 PRRSV有2個(gè)基因型，歐洲型和美洲型

歐洲型通常引起經(jīng)典性豬藍(lán)耳病，使豬免疫力低下，繼發(fā)感染，長(zhǎng)期帶毒；美洲型通常引起豬高致病性藍(lán)耳?。℉P-PRRSV），通常誘導(dǎo)產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，造成豬急性的肺臟炎性損傷，導(dǎo)致豬的急性死亡，對(duì)豬群危害嚴(yán)重[8]。據(jù)江松澤等對(duì)2011-2014年江西省境內(nèi)所選取的8份陽(yáng)性血清中檢測(cè)的PRRSV毒株均屬于美洲型毒株[9]。說(shuō)明我國(guó)現(xiàn)在流行的豬藍(lán)耳病主要是高致病性藍(lán)耳病。根據(jù)本病例仔豬發(fā)病后的一系列病理變化，其感染的PRRSV基因型可能也是美洲型毒株。作者沒(méi)有對(duì)PRRSV做更進(jìn)一步的遺傳進(jìn)化分析。

6.4 CSF和PRRS的預(yù)防重點(diǎn)是通過(guò)抗體監(jiān)測(cè)來(lái)準(zhǔn)確知道兩病的免疫時(shí)間和免疫效果

1)CSF抗體監(jiān)測(cè)的判定標(biāo)準(zhǔn)：抗體滴度為1∶32～64時(shí)進(jìn)行攻毒可獲得100%保護(hù)，當(dāng)抗體滴度下降到1∶16～32時(shí)能達(dá)到80%保護(hù)，當(dāng)抗體滴度下降到1∶8時(shí)則完全不能保護(hù)[10]，由此可見(jiàn)1∶16的抗體滴度是最低保護(hù)的臨界值；采用ELSIA抗體檢測(cè)法檢測(cè)，其保護(hù)值OD450nm值0.41是最低保護(hù)的臨界值[11]。

2)PRRS抗體監(jiān)測(cè)的判定標(biāo)準(zhǔn)：采用ELSIA抗體檢測(cè)法檢測(cè)，通過(guò)計(jì)算樣品孔與陽(yáng)性孔OD630nm比值S/P值來(lái)判定被檢血清PRRSV抗體的結(jié)果，當(dāng)S/P值＞0.42，判定被檢血清豬藍(lán)耳病病毒抗體陽(yáng)性；當(dāng)S/P值＜0.42，則判定被檢血清豬藍(lán)耳病病毒抗體陰性[12]。但豬藍(lán)耳病ELISA檢測(cè)抗體水平的高低與攻毒保護(hù)率之間無(wú)明顯的正相關(guān)關(guān)系，無(wú)論是IDEXX的抗體檢測(cè)試劑盒，還是LSI的豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)試劑盒，即使兩項(xiàng)抗體檢測(cè)均為陽(yáng)性的豬群，攻毒后仍然會(huì)出現(xiàn)發(fā)病甚至死亡。所以，我們不能將豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)作為是否提供有效保護(hù)的依據(jù)，而是通過(guò)ELISA抗體水平對(duì)豬群的感染狀況進(jìn)行評(píng)估，即在免疫豬群中可以通過(guò)抗體水平的離散度、抗體值的高低等間接評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果[13]。

6.5 發(fā)生CSF和 PRRS混感后的處理措施

1)豬群應(yīng)該緊急免疫注射2～4頭份豬瘟細(xì)胞苗，同時(shí)注射2～4 mL豬高致病性藍(lán)耳病滅活苗。據(jù)杜善忠等（2010）研究證實(shí)，豬高致病性藍(lán)耳病滅活苗對(duì)豬瘟弱毒苗免疫無(wú)干擾作用，兩者可以同時(shí)免疫；豬藍(lán)耳病弱毒苗與豬瘟弱毒苗同時(shí)免疫，才對(duì)豬瘟疫苗的免疫有極顯著的干擾作用。

2)使用抗菌藥物防止繼發(fā)感染，如多西環(huán)素，按每噸飼料加入150～250 g；或氟苯尼考，按每噸飼料加入60～100 g。同時(shí)加入維生素C用于增強(qiáng)免疫力，按每噸飼料加入400～600 g，連用5～7 d。

3）及時(shí)淘汰病情嚴(yán)重的仔豬，并與病死豬一起做無(wú)害化處理；對(duì)發(fā)病較輕的仔豬可以進(jìn)行隔離治療觀察、精心護(hù)理。

4）及時(shí)清理（如沖刷）豬只排泄物，對(duì)豬場(chǎng)內(nèi)外環(huán)境及用具等進(jìn)行全面嚴(yán)格消毒，如使用0.1%～0.2%三氯異氰尿酸鈉溶液，也可帶豬消毒。

6.6 小結(jié)

1）CSF診斷要點(diǎn)：病豬皮膚出現(xiàn)紫斑及出血點(diǎn)；排稀糞或干糞，干糞表面附有黏液；淋巴結(jié)腫大、出血，橫斷面呈現(xiàn)“大理石樣”花紋；腎臟貧血且有針尖狀出血點(diǎn)；脾臟有出血性梗死；亞急性或慢性CSF于回盲口及大腸黏膜上出現(xiàn)“扣狀”潰瘍?cè)?。確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，如RT-PCR檢測(cè)等。

2）PRRS診斷要點(diǎn)：病豬咳嗽、氣喘，常見(jiàn)排稀糞，個(gè)別出現(xiàn)嘔吐現(xiàn)象；耳廓常見(jiàn)藍(lán)紫色；淋巴結(jié)髓樣腫大；氣管內(nèi)可見(jiàn)泡沫狀液體，肺臟出現(xiàn)淤血、出血、水腫，呈現(xiàn)片狀實(shí)變現(xiàn)象。確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，如RT-PCR檢測(cè)等。

3）CSF和PRRS混感的防控要求：重視并嚴(yán)格執(zhí)行生物安全措施，做好兩病的免疫注射及免疫效果監(jiān)測(cè)。搞好飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)豬只抗病能力，切實(shí)保障豬群健康。如果發(fā)現(xiàn)豬群豬只有異樣，應(yīng)到具備實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的診療機(jī)構(gòu)進(jìn)行及時(shí)確診，并及時(shí)采取科學(xué)有效的處理方案，最大限度地減少損失。該批斷奶仔豬剛剛購(gòu)進(jìn)一個(gè)月，其死亡率就高達(dá)80%以上，確實(shí)始料未及，損失如此慘重，值得我們深思。

[1] 劉建柱，牛緒東.豬病鑒別診斷圖譜與安全用藥[M].北京：機(jī)械工業(yè)出版社，2017.

[2] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].5版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013.

[3] 董亞青，郭廣富，朱愛(ài)萍，等.豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016，27（11）：126-128.

[4] 曹劍，張磊，李巖.規(guī)?；i場(chǎng)仔豬豬瘟母源抗體效價(jià)動(dòng)態(tài)檢測(cè)[J].新疆農(nóng)墾科技，2012（2）：26-28.

[5] 杜善忠，胡旭進(jìn)，樓芳芳，等.豬瘟和藍(lán)耳病母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律及疫苗免疫的干擾作用[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：1118-1120.

[6] 吳九州.豬藍(lán)耳病與豬瘟并發(fā)的診治[J].當(dāng)代畜牧，2016（3）：102-103.

[7] 張健，高俊，任凱.豬瘟的診斷與防治[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2015，31（12）：113-114.

[8] 陳澤芳，趙愛(ài)莉.豬藍(lán)耳病的研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè)，2017，28（3）：1-3，6.

[9] 江松澤，汪 志，師東方，等.2011—2014年江西地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2016，41（6）：34-37，43.

[10] 范有明，豬瘟的預(yù)防措施[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2014，30（12）：110-111.

[11] 戢澤雙，李影，劉彪，等.仔豬豬瘟母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，19（3）：9-10，21.

[12] 劉清源.豬藍(lán)耳病滅活疫苗與弱毒疫苗免疫后的抗體水平比較[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2017，42（2）：32-34.

[13] 代洪波，李 琰，林艷，等.豬藍(lán)耳病疫苗現(xiàn)狀及其免疫效果評(píng)價(jià)方法[J].豬業(yè)科學(xué)，2016，33（12）：96-97.