殼聚糖及其衍生物的抗氧化應(yīng)激和抗炎癥作用機(jī)制

鄭亞光 閆素梅 史彬林 張博綦 趙艷麗

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的。甲殼素又稱甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，是1811年由法國化學(xué)家Henri Braconnot首先從蘑菇中分離的，是最早知道的多糖，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是世界上第二大豐富的天然生物聚合物，其中海洋生物儲量達(dá)到106～107t[1]。甲殼素可被強(qiáng)酸分解成乙酸和殼聚糖，也可以通過纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶和殼聚糖酶等非特異性酶作用，進(jìn)一步生成殼聚糖和氨基葡萄糖2個主要衍生物[2]。殼聚糖或幾丁質(zhì)通過酸水解和酶降解方法可得到幾丁質(zhì)寡糖(chitin oligosaccharide，NACOS)和殼聚糖寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)。大量研究表明，殼聚糖是一類具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗糖尿病、抗癌和降膽固醇特性的生物活性陽離子多糖，同時具有抗氧化與抗炎癥作用，對飼料中綠色飼料添加劑的開發(fā)應(yīng)用具有重要的意義；殼聚糖的衍生物NACOS和COS的水解產(chǎn)物易溶于水，在中性pH下具有低黏度和較高溶解度，由于氫鍵的作用減弱，顯示出更好的抗氧化活性，使得其在生產(chǎn)和研究中的應(yīng)用更加廣泛[3-4]。本文綜述了殼聚糖及其衍生物抗氧化、抗炎癥等作用的相關(guān)機(jī)制，為其深入研究及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 殼聚糖及其衍生物的抗氧化與抗炎癥作用

殼聚糖及其衍生物具有重要的生物抗氧化作用，在體內(nèi)研究中，殼聚糖通過降低全身循環(huán)中的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，表現(xiàn)出直接的抗氧化活性。大鼠飼糧中補(bǔ)充殼聚糖可減弱心肌中由于異丙腎上腺素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，并增強(qiáng)幼齡和老年大鼠的谷胱甘肽(GSH)依賴型抗氧化系統(tǒng)，從而提高抗衰老作用[5]。在小鼠巨噬細(xì)胞的研究中證實(shí)，NACOS對骨髓細(xì)胞中的髓過氧化物酶(MPO)活性具有抑制作用[6]。NACOS提高細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性和GSH含量，表明NACOS在活細(xì)胞中可以作為有效的抗氧化劑[7]。研究表明，COS可抑制鼠黑素瘤細(xì)胞系中細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)GSH含量增加，對基因組DNA的氧化損傷具有保護(hù)作用[8]。COS對過氧化氫誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的氧化損傷具有保護(hù)作用，活性氧(reactive oxygen species，ROS)可氧化生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物和DNA等，是引起細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要自由基之一[9]，除了細(xì)胞內(nèi)ROS水平的顯著降低外，COS還對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛的產(chǎn)生具有抑制作用，恢復(fù)內(nèi)源性抗氧化劑(包括超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶)的活性，提高一氧化氮(NO)承載力和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)活性，說明COS可以有效地保護(hù)HUVEC免受過氧化氫的氧化應(yīng)激，提示COS在預(yù)防和治療心血管疾病中將發(fā)揮重要的作用[10]。COS能夠保護(hù)人胚胎肝細(xì)胞免受過氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，表明COS對臨床肝損傷期間可能存在的氧化應(yīng)激具有減緩作用[11]。

研究表明，在干乳期奶?；A(chǔ)飼糧中添加殼聚糖，可顯著提高血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)的含量，提示殼聚糖可以作為奶牛的免疫增強(qiáng)劑[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可以顯著提高奶牛的4%標(biāo)準(zhǔn)乳產(chǎn)量，提高血液中活性T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞含量，顯著提高血清中IgM、IgG含量[13]。飼糧中添加一定劑量的殼聚糖可顯著提高奶牛的產(chǎn)奶量，降低乳中體細(xì)胞數(shù)，并可增強(qiáng)奶牛的抗氧化能力，血清超氧化物歧化酶(SOD)活性與總抗氧化能力(T-AOC)均呈明顯的升高趨勢[14]；殼聚糖可能通過提高抗氧化能力緩解斷奶應(yīng)激，進(jìn)而促進(jìn)了斷奶仔豬的免疫功能[15]；對肉牛的試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，飼糧中適宜劑量的殼聚糖可提高肉牛的抗氧化和免疫功能[16]。殼聚糖對肉仔雞生長和免疫的影響與添加量有關(guān)。飼糧添加0.05%殼聚糖時，可明顯提高肉仔雞的生長性能；而添加更高水平殼聚糖時，雖免疫功能有所增強(qiáng)，但生長性能卻有下降趨勢。因此，0.05%可看作殼聚糖的適宜添加量。此外，適宜添加量的殼聚糖可在一定程度上改善肉仔雞的腸道微生態(tài)環(huán)境[17]。另有試驗(yàn)研究了蛋雞飼糧中添加不同水平殼聚糖對蛋品質(zhì)及蛋黃抗氧化指標(biāo)的影響，飼糧中適宜添加量的殼聚糖可在一定程度上改善蛋雞的蛋品質(zhì)和蛋黃的抗氧化指標(biāo)，還可以降低脂肪酶活性和粗脂肪表觀代謝率，提高蛋白酶活性和其他營養(yǎng)物質(zhì)的表觀代謝率[18]。COS可減輕試驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠的眼部炎癥，通過減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)預(yù)防視網(wǎng)膜缺血和灌注損傷[19]。飼糧中適宜添加量的殼聚糖能夠促進(jìn)斷奶仔豬的生長，降低腹瀉，緩解斷奶應(yīng)激[20]。

2 殼聚糖及其衍生物的抗氧化應(yīng)激與抗炎癥作用機(jī)制

2.1 通過調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抗炎癥作用

腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，巨噬細(xì)胞在分泌NO和促炎細(xì)胞因子如TNF-α和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的免疫應(yīng)答中起重要作用[21]。巨噬細(xì)胞被脂多糖(LPS)誘導(dǎo)激活后，可產(chǎn)生和釋放大量的iNOS，進(jìn)而模擬建立不同的炎性疾病模型，包括組織損傷和敗血性休克[22]，以研究殼聚糖及其衍生物的抗氧化應(yīng)激和抗炎癥作用機(jī)制。許多研究報道了COS的抗炎性質(zhì)，研究了COS對LPS刺激的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)添加COS可引起LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6分泌及其mRNA表達(dá)呈劑量依賴性降低，COS可以降低LPS誘導(dǎo)的NO分泌，小鼠RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中添加COS逆轉(zhuǎn)了TNF-α介導(dǎo)的IL-6和NO含量的降低，從而表明COS的抗炎作用是通過調(diào)節(jié)TNF-α進(jìn)而降低NO的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的[23]。另有研究表明，經(jīng)預(yù)處理的低分子量硫酸化殼寡糖可抑制因LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞中NO、IL-6和TNF-α炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，硫酸化殼寡糖可通過核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路活化的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路調(diào)節(jié)抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-6和TNF-α的產(chǎn)生[24]。通過確定虹膜睫狀體(iris ciliary body，ICB)的臨床評分和形態(tài)來評估COS的作用，COS的治療以劑量依賴的方式顯著減輕了ICB的臨床評分，有效降低炎癥介質(zhì)(TNF-α、iNOS等)的表達(dá)[25]。殼聚糖被證實(shí)可部分抑制肥大細(xì)胞中白細(xì)胞介素-8(IL-8)和TNF-α的分泌，表明殼聚糖具有降低過敏性炎癥反應(yīng)的潛力，肥大細(xì)胞的過敏反應(yīng)中產(chǎn)生的炎性因子涉及許多神經(jīng)炎癥性疾病，殼聚糖及其衍生物可能有助于預(yù)防或減輕其中的一些并發(fā)癥[26]。

有研究表明，不同片段大小的甲殼素可刺激Toll樣受體2(TLR2)、甘露糖受體和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，差異性激活NF-κB信號通路和脾臟酪氨酸激酶(spleentyrosine kinase，Syk)，通過多形核白細(xì)胞促進(jìn)吞噬作用產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1(IL-1)和血小板衍生生長因子，并通過成纖維細(xì)胞產(chǎn)生IL-8介導(dǎo)免疫反應(yīng)。研究指出，幾丁質(zhì)具有炎癥調(diào)節(jié)作用，中等大小甲殼素和小甲殼素都能刺激小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的TNF-α產(chǎn)生，但大甲殼素片段是惰性的[27]。還有研究報道了殼聚糖和季銨化殼聚糖(quaternized chitosan，HTCC)對LPS刺激的人牙周膜細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α產(chǎn)生的影響，殼聚糖抑制了IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生而HTCC增加了IL-1β和TNF-α產(chǎn)生[28]。目前相關(guān)的研究報道甚少，需要進(jìn)一步探討。

2.2 通過抑制NF-κB信號通路降低NO產(chǎn)生

NO是生物體內(nèi)的一種氣體信號分子和活性氮自由基，介導(dǎo)許多生物功能，如宿主防御、神經(jīng)傳遞、神經(jīng)毒性和血管舒張[29]。NO是由L-精氨酸向L-瓜氨酸轉(zhuǎn)化過程中生成的，并通過一氧化氮合成酶(NOS)內(nèi)源合成，共有3種類型的NOS異構(gòu)體，包括神經(jīng)元一氧化氮合成酶(nNOS)、內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOS)和iNOS。巨噬細(xì)胞來源的NO在生理、病理和炎癥反應(yīng)中起重要作用，活化的巨噬細(xì)胞對抗原增殖的抑制作用部分歸因于NO。巨噬細(xì)胞在通過分泌NO和促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6的免疫應(yīng)答中起重要作用，然而NO的過量產(chǎn)生導(dǎo)致各種疾病如動脈粥樣硬化、惡性腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、組織損傷和敗血性休克發(fā)生概率的增加[30]。

NF-κB是活化的B細(xì)胞與核因子的免疫球蛋白κ輕鏈增強(qiáng)子元件的結(jié)合，具有這種特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)在大部分細(xì)胞中都具有多種調(diào)控功能[31]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在慢性炎癥中起重要的作用，對參與免疫應(yīng)答反應(yīng)的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。除了其在先天免疫中的作用外，NF-κB信號傳導(dǎo)可以控制細(xì)胞增殖和凋亡，NF-κB激活通常導(dǎo)致抗凋亡基因的上調(diào)，從而提高細(xì)胞存活能力以抵御炎癥反應(yīng)。已經(jīng)證實(shí)NF-κB誘導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6和IL-8)，以及黏附分子并導(dǎo)致白細(xì)胞募集到炎癥部位[32]。在典型的激活途徑中，興奮性信號可以通過Toll-樣受體(Toll-like receptors，TLR)、IL-1受體、腫瘤壞死因子受體和抗原受體介導(dǎo)，這些受體接收刺激后導(dǎo)致了IκB-激酶復(fù)合物的激活，從而活化NF-κB[33]。

在小鼠胰腺β細(xì)胞系MIN6中硫酸化殼寡糖(COS-S)對過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制的報道中，COS-S顯著抑制了NO產(chǎn)生，同時抑制iNOS的活性及其mRNA表達(dá)以及NF-κB蛋白p65的蛋白水平[34]。這些結(jié)果表明，COS-S的抗氧化能力可能與其阻斷了NF-κB信號通路有關(guān)。在小鼠的RAW 264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中，使用COS可以減少LPS誘導(dǎo)引起的炎癥反應(yīng)，降低了LPS誘導(dǎo)的NF-κB/p65糖基化修飾的水平。這是因?yàn)镹F-κB糖基化修飾水平的下調(diào)可能有助于NF-κB/p65核移位和降低NF-κB通路的活化，進(jìn)而下調(diào)了炎性細(xì)胞因子的基因表達(dá)[35]。有研究表明，酶消化高分子質(zhì)量殼聚糖制備的低分子質(zhì)量殼聚糖寡糖(LM-COS)對體內(nèi)和體外過敏反應(yīng)和過敏性哮喘具有抗炎作用，LM-COS對哮喘模型小鼠中卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的肺部炎癥具有保護(hù)作用，口服LM-COS導(dǎo)致白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、TNF-α的mRNA和蛋白水平顯著降低[36]。這表明LM-COS可以消除體內(nèi)哮喘癥狀，這些作用可以由其介導(dǎo)抑制OVA誘導(dǎo)的氣道炎癥期間Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)。此外，NF-κB調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，LM-COS抑制由免疫球蛋白E(IgE)-抗原復(fù)合物刺激的RBL-2H3細(xì)胞中NF-κB的活化[37]。

2.3 通過抑制MAPK信號通路降低NO的生成

MAPK通路是促炎癥反應(yīng)中的重要細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路之一，骨髓分化因子-88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)途徑介導(dǎo)MAPK的活化。MAPK包含3個亞家族：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)、c-jun-氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)和p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)[38]。這些激酶通過降解IκB-α來激活下游的NF-κB調(diào)節(jié)炎癥基因的表達(dá)。LPS刺激的巨噬細(xì)胞中MyD88和β干擾素TRI結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)依賴性信號通路的激活是通過iNOS表達(dá)獲得的[39]。Toll樣受體4(TLR4)是識別LPS并通過2種基本途徑釋放炎癥介質(zhì)的細(xì)胞外受體，即MyD88途徑和包含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接子誘導(dǎo)TRIF途徑。研究發(fā)現(xiàn)，COS通過JNK抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中iNOS的產(chǎn)生[40]。

有研究報道了COS在LPS誘導(dǎo)的仔豬敗血癥中的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)COS不僅減緩了仔豬腸道器官功能障礙，還可以提高LPS注射后的存活率。為了進(jìn)一步剖析機(jī)制，研究了腸道中的嗜中性粒細(xì)胞和血清中的TNF-α和IL-1β等幾種促炎癥標(biāo)志物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)COS處理的仔豬中這些細(xì)胞因子的含量顯著降低；由LPS誘導(dǎo)引起的仔豬敗血癥，其GSH和CAT的消耗增加，且丙二醛含量升高，導(dǎo)致了氧化還原失衡，而COS可逆轉(zhuǎn)這一氧化還原失衡[41]。此外，由LPS激活的信號通路，如JNK和p38，在COS處理后得到緩解，這些結(jié)果表明，COS通過對MAPK信號通路的抑制作用實(shí)現(xiàn)其對LPS誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激模型的保護(hù)作用[42]。有報道研究了COS對LPS誘導(dǎo)的N9小膠質(zhì)細(xì)胞中NO產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COS預(yù)處理可通過抑制活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中的iNOS表達(dá)來抑制NO產(chǎn)生，COS可抑制LPS誘導(dǎo)的p38 MAPK和ERK的磷酸化；COS預(yù)處理也可以抑制NF-κB和激活蛋白-1的活化[43]。這些結(jié)果進(jìn)一步說明殼聚糖及其衍生物的抗氧化應(yīng)激作用是通過抑制MAPK和NF-κB信號通路的活化，引起iNOS表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制NO的生成實(shí)現(xiàn)的。

2.4 通過調(diào)節(jié)脂類代謝發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用

低密度脂蛋白(LDL)的氧化與冠狀動脈粥樣硬化有關(guān)。LDL氧化后高水平的膽固醇氧化產(chǎn)物對內(nèi)皮細(xì)胞有毒性[44]。巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中的保護(hù)作用主要通過清除免疫調(diào)節(jié)因子如TNF-α和IL-1等刺激因子促進(jìn)了LDL與內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌的結(jié)合?？寡趸瘎┩ㄟ^抑制單核細(xì)胞黏附分子的上調(diào)，增強(qiáng)人體中LDL的抗氧化能力，從而發(fā)揮免疫作用。高密度脂蛋白可以抑制由細(xì)胞因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)[45]。許多資料報道了殼聚糖具有降低膽固醇含量的效應(yīng)，研究表明，殼聚糖及其衍生物對血清中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量的降低有著顯著作用[46]。有報道證實(shí)，飼喂小鼠12周γ射線照射的殼聚糖，其體內(nèi)總膽固醇含量顯著低于對照組[47]。攝入低分子質(zhì)量的殼聚糖可以抑制血液透析患者中常見的血清白蛋白的氧化，進(jìn)而降低與尿毒癥相關(guān)的氧化應(yīng)激。此外，羧化殼寡糖能夠抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的自由基介導(dǎo)的氧化，同時降低小鼠巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)氫過氧化物的水平和羰基碳含量，從而發(fā)揮其抗氧化作用。

3 小 結(jié)

綜上所述，殼聚糖及其衍生物主要通過抑制NF-κB和MAPK信號通路降低NO的生成，調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫因子發(fā)揮其抗氧化及抗炎性功能，也可通過調(diào)節(jié)脂類代謝發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的功能。

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