腎臟銅穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

李 鶴，孫勝悅，黃元龍，楊文艷,2,楊連玉,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，吉林長春 130118)

銅參與包括以糖類、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)素形式等存在，在細(xì)胞呼吸作用下釋放能量，并將多余的能量儲存于腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)中，ATP用于酶催化合成、細(xì)胞跨膜運(yùn)輸和蛋白質(zhì)降解。銅維持生命不僅需要細(xì)胞中銅的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，而且需要銅轉(zhuǎn)運(yùn)到與其相應(yīng)的配體中，避免氧化應(yīng)激反應(yīng)(Oxidative stress reaction,ROS)。銅穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)需通過有效、正確地運(yùn)輸和儲存金屬，來滿足其在細(xì)胞、器官以及個體的需要。此外，在哺乳動物的整個生命周期中，不同的發(fā)育階段，器官對銅的需求量也不同。實際上，肝臟銅含量最高，其次是大腦、心臟和腎臟，肌肉和骨骼銅含量最低。銅的排泄,一部分通過膽汁,由糞便排出,另一部隨血液經(jīng)腎臟濾過,由尿液排出[1]。腎臟既是銅的排泄器官也是儲銅器官。有研究報道腎臟是僅次于肝臟的第二儲銅器官,腎臟的銅含量隨著飼糧銅添加水平的增加而增加[2]。本文將闡述銅在腎臟細(xì)胞及組織中的吸收、儲存和排泄的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，以揭示哺乳動物機(jī)體銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 腎臟細(xì)胞銅攝入與其胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)

1.1 銅的攝入與腎臟細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)

腎臟作為銅排泄的器官，在銅穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了一定作用。無論是缺銅或銅積累條件，腎臟會調(diào)控銅的含量來維持銅穩(wěn)態(tài)。腎臟中腎小球的濾過作用可維持機(jī)體的滲透壓及血壓平衡，而腎小管和集合管的重吸收與分泌作用可進(jìn)行物質(zhì)跨模轉(zhuǎn)運(yùn)。動物通過日糧攝取銅后，進(jìn)入血液，經(jīng)過腎小管和集合管的重吸收作用，與多種銅轉(zhuǎn)運(yùn)因子結(jié)合，將銅轉(zhuǎn)運(yùn)至小管液中，最終隨著尿液排出體外。腎小管上皮細(xì)胞是銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CTR1)轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所，髓袢細(xì)胞為銅轉(zhuǎn)運(yùn)P型ATP酶(ATP7A,ATP7B)的主要場所，在集合管細(xì)胞中細(xì)胞色素氧化酶與銅進(jìn)行結(jié)合的主要場所。研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)平衡不僅依靠CTR1、ATP7A、ATP7B之間相互調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)[3]，而且需要兩種重要的銅伴侶蛋白，即抗氧化蛋白1(ATOX1)、超氧化物歧化酶伴侶蛋白(CCS)，以及在腎細(xì)胞中特異性不強(qiáng)的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CTR2)，還有在腎臟銅穩(wěn)態(tài)中降低銅毒性具有重要作用的金屬硫蛋白(MT)。

1.2 銅在腎臟細(xì)胞內(nèi)儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)及胞內(nèi)的銅穩(wěn)態(tài)

對哺乳動物而言，銅攝取可維持其正常的生長發(fā)育，CTR1對銅吸收具有關(guān)鍵作用。研究表明，適當(dāng)水平的銅可維持雄鼠的精子發(fā)生，在銅過量時CTR1可轉(zhuǎn)運(yùn)銅至生精小管以維持細(xì)胞銅的穩(wěn)態(tài)[4]。CTR1活性受到其表達(dá)位置和胞內(nèi)銅濃度的調(diào)控。CTR1定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的囊泡中，并隨著銅濃度的升高產(chǎn)生胞吞作用。付世鑫等研究證實在銅添加量在7.8 μmoL/L～62.5 μmoL/L的豬腎PK-15細(xì)胞中，Ctr1mRNA 表達(dá)呈雙相反應(yīng)[5]。而在銅濃度過高時，CTR1蛋白會通過加速銅轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)，來維持機(jī)體內(nèi)銅水平的穩(wěn)定。Cheng J等[6]在在魚類腸道吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)銅中發(fā)現(xiàn)，魚的腸上皮細(xì)胞隨著銅濃度的升高，CTR1蛋白降解加快。銅通過血液進(jìn)入腎小管上皮細(xì)胞，CTR1轉(zhuǎn)運(yùn)銅來調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)。低銅時，CTR1氨基末端蛋氨酸修飾后，內(nèi)化至細(xì)胞質(zhì)膜以攝取外周銅。高銅時，CTR1分布在腎小管細(xì)胞胞內(nèi)，降低胞內(nèi)銅的轉(zhuǎn)入，并以流動性胞內(nèi)銅池的形式貯存銅[7]。CTR1在近端和遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，并通過腎小球濾過的原尿?qū)~循環(huán)回到血液，此時腎臟CTR1水平升高，全身銅含量降低，這可能有助于尿銅的吸收[8]。總之，CTR1分布在腎臟細(xì)胞不同的亞細(xì)胞器上，不同的功能分布促使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CTR2，與CTR1結(jié)構(gòu)類似，有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，與哺乳動物CTR1的作用的結(jié)構(gòu)、生理功能相反，對CTR2的作用報道較少。CTR2在哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)銅從囊泡進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，CTR2在細(xì)胞質(zhì)膜對銅轉(zhuǎn)運(yùn)親和力較低。研究發(fā)現(xiàn)，缺少CTR2 mRNA細(xì)胞中唐氏綜合征發(fā)病率增加，這表明CTR2可能調(diào)解細(xì)胞的吞噬作用[9]。雖然CTR2已被證實在銅轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮一定作用，但是關(guān)于CTR1與CTR2在銅穩(wěn)態(tài)細(xì)胞模型中是否有協(xié)同調(diào)節(jié)的機(jī)制并不明確，有待進(jìn)一步的研究。

金屬硫蛋白(MT)是腎臟銅吸收的另一個轉(zhuǎn)入因子，雖然能攜帶多種二價金屬離子(Fe2+、Cu2+、Zn2+等)，但Cu2+與其他二價金屬相比與MT結(jié)合更加密切。隨著銅濃度的增加，腎組織MT含量增高，這可能對腎臟組織細(xì)胞起到保護(hù)作用[10]。而在銅缺乏時，缺乏MT的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞存活率降低,這揭示了MT在細(xì)胞中是銅的一種儲存蛋白，在銅缺乏時可以發(fā)揮作用。以上表明腎臟銅穩(wěn)態(tài)中，MT在銅攝取方面具有一定的促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用。

1.3 銅在腎臟細(xì)胞內(nèi)儲存、轉(zhuǎn)運(yùn)及胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的可持續(xù)性

進(jìn)入細(xì)胞的銅能立即與其相關(guān)小肽和蛋白結(jié)合，從而達(dá)到消除或抑制銅自由基高毒性的作用。在銅過量時，可通過銅螯合物調(diào)控在銅儲存發(fā)揮生理作用[11]。為此，相關(guān)研究大量報道了這些輔助因子即銅伴侶蛋白，銅伴侶蛋白對銅具有較高的親和性。在某些非特定反應(yīng)中，銅通過銅結(jié)合蛋白之間的相互作用來確保銅離子傳遞到適合的靶細(xì)胞器，從而達(dá)到了細(xì)胞內(nèi)銅的貯存、自由基清除，最終形成了腎細(xì)胞的銅穩(wěn)態(tài)。

1.3.1 細(xì)胞質(zhì)中銅-CCS-SOD1調(diào)節(jié) 銅離子進(jìn)入腎臟細(xì)胞，通過銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的銅伴侶蛋白和其他配體(如谷胱甘肽或MT)中。銅伴侶蛋白CCS，以二聚體的形式存在。CCS單體由249個氨基酸殘基組成，包含了3個功能結(jié)構(gòu)域。CCS能夠?qū)~離子轉(zhuǎn)運(yùn)到超氧化物歧化酶1(SOD1)上，促使二硫鍵的形成并激活SOD1。CCS需要Cu、Zn將銅傳遞到SOD1，細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)通過CCS翻譯調(diào)節(jié)的，其表達(dá)水平與哺乳動物26S蛋白酶有關(guān)。在銅缺乏和細(xì)胞內(nèi)銅升高時，CCS水平降低，導(dǎo)致SOD1蛋白水平表達(dá)升高。雖然CCS的調(diào)節(jié)不直接影響SOD1蛋白表達(dá)，但對其酶活具有調(diào)節(jié)作用。研究表明,CCS基因敲除的小鼠，SOD的酶活顯著降低到10%～30%[12]。這表明CCS對SOD1的激活是非常重要的，CCS的獨立通路實現(xiàn)將銅直接傳遞到SOD1。研究表明,對于缺乏CCS的秀麗線蟲中，CCS的產(chǎn)生會直接影響銅-谷胱甘肽復(fù)合物形成[13]。

1.3.2 細(xì)胞質(zhì)中銅-Atox1調(diào)節(jié) 與酵母中銅伴侶銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Atx1-Ccc2)轉(zhuǎn)運(yùn)銅到分泌器官作用相似，同源哺乳動物銅伴侶蛋白(Atox1)轉(zhuǎn)運(yùn)銅到ATP酶上(ATP7A和ATP7B)。小鼠缺乏Atox1會使胎盤中的銅轉(zhuǎn)運(yùn)降低，導(dǎo)致新生仔鼠腦和肝臟銅缺乏。缺乏Atox1還會導(dǎo)致具有銅依賴性細(xì)胞色素氧化酶和酪氨酸酶活性的降低。缺乏Atox1的新生兒也表現(xiàn)出圍產(chǎn)期及出生后生長嚴(yán)重受損，這表明Atox1在胎盤及全身的ATP7A/B的介導(dǎo)銅轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。除了銅伴侶在細(xì)胞質(zhì)中的作用外,Atox1也可以作為一個轉(zhuǎn)錄因子，在高銅的條件下從細(xì)胞核轉(zhuǎn)入，并與細(xì)胞增殖有關(guān)的其他基因(如細(xì)胞周期蛋白D1)結(jié)合，刺激胞外編碼超氧化物歧化酶(SOD)蛋白家族成員SOD3基因的表達(dá)[15]。Atox1可調(diào)節(jié)銅并ATP7A/B運(yùn)輸銅到細(xì)胞外的分泌腔。在高銅條件下，Atox1在細(xì)胞核中積累并激活靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。

1.3.3 線粒體中銅-CCO調(diào)節(jié) 在哺乳動物中，細(xì)胞色素氧化酶(CCO)是線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ，由13個亞基組成，其中10個由核基因編碼，3個由線粒體基因編碼。與酵母相同，銅轉(zhuǎn)運(yùn)到環(huán)氧化物水解酶(Cox1和Cox2)兩個線粒體編碼的亞基中,并與CCO銅伴侶蛋白(Cox17、Cox11、Sco1和Sco2)協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)。缺乏Cox17的小鼠會導(dǎo)致CCO活性受損，胚胎在子宮內(nèi)早期死亡，這證明線粒體中銅分子伴侶是必要的[16]。在細(xì)胞培養(yǎng)中，CCO與銅的亞基相結(jié)合，降低了Cox1和Cox2蛋白表達(dá)以及CCO活性，Cox17穩(wěn)定表達(dá)受阻[17]，CCO的銅伴侶蛋白Sco1和Sco2蛋白可以將Cox17和2個Cu原子轉(zhuǎn)運(yùn)到Cox2的Cu A位點。降低CCO活性會引起新生兒肝功能衰竭和肥厚性心肌病，增加了新生兒的死亡率。與Atox1、Sco1、Sco2作用相一致，CCO已被證實不僅是銅關(guān)鍵的組合因子，而且對銅穩(wěn)態(tài)中細(xì)胞銅轉(zhuǎn)運(yùn)有調(diào)節(jié)作用。而這些與線粒體相關(guān)蛋白顯然在CCO的合成中發(fā)揮重要作用，銅轉(zhuǎn)入特定亞基的過程目前還不清楚，銅是如何通過其他轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)入線粒體的還有待研究。

2 銅的轉(zhuǎn)出及排泄與腎臟細(xì)胞內(nèi)的銅穩(wěn)態(tài)

銅經(jīng)過腎臟腎小管和集合管的重吸收作用，吸收的Cu2+離子在胞內(nèi)形成銅池，而銅的轉(zhuǎn)出、排泄途徑會限制胞內(nèi)銅池的含量，并將過量的銅排泄到原尿中，將銅排出，確保腎臟細(xì)胞的銅穩(wěn)態(tài)平衡。哺乳動物的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶(ATP7A和ATP7B)，負(fù)責(zé)將銅轉(zhuǎn)運(yùn)到分泌腔，并與銅依賴酶如銅藍(lán)蛋白，酪氨酸酶和其他酶結(jié)合。此外，ATP7A和ATP7B在特定的細(xì)胞和組織銅轉(zhuǎn)出的過程中起關(guān)鍵作用。這些銅泵主要是通過從胞漿銅伴侶Atox1接受銅，與ATP7A和ATP7B銅跨膜泵與其生理機(jī)制相似，它們在銅轉(zhuǎn)出過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[18]。ATP7A基因突變導(dǎo)致門克斯(Menkes)病變，致使腸銅阻塞、外周銅缺乏而產(chǎn)生致命危險，此癥狀通常發(fā)生在2或3周齡。在生理上，Menkes病的表現(xiàn)是無法開啟腸上皮細(xì)胞基底膜的邊緣的銅泵，或者穿過血腦屏障，導(dǎo)致腸道銅的堆積、外周銅依賴酶供應(yīng)減少。ATP7B基因突變導(dǎo)致威爾遜(Wilson)病，其原因是銅在肝臟和神經(jīng)組織中的過度積累。由于ATP7A和ATP7B功能是跨膜運(yùn)輸銅，因此產(chǎn)生不同疾病時，會導(dǎo)致特定的細(xì)胞和組織發(fā)生病變。

在銅飽合的情況下，通過腎小球毛細(xì)血管濾過作用銅排出量相對較低。研究表明腎臟中銅缺乏癥是很難治愈的,腎臟與其他組織相比更能抵抗低銅狀態(tài)[19]。ATP7A和ATP7B共同定位于近端和遠(yuǎn)端腎小管的細(xì)胞中，然而只有ATP7A已報道在高銅情況下在部分腎臟基底膜表達(dá),研究發(fā)現(xiàn) ATP7B 在小鼠腎小球及腎髓質(zhì)中表達(dá)[20]。隨著細(xì)胞中的銅離子濃度增加，血液會以儲存銅或肝臟排泄銅來保護(hù)腎細(xì)胞免受銅毒性[21]。敲除腎臟中CTR1或ATP7A/B的小鼠可以作為一種分析腎臟在銅系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮的作用的工具。對其研究，可發(fā)現(xiàn)在腎臟中銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對銅的抑制作用。

3 其他類上皮細(xì)胞組織銅穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制的啟發(fā)

比較不同上皮細(xì)胞的銅平衡規(guī)律可能有助于揭示腎臟細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)調(diào)控的新途徑。在胎盤和乳腺的上皮細(xì)胞銅轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，會發(fā)生類似腎小管上皮細(xì)胞一樣的跨越上皮細(xì)胞屏障現(xiàn)象。在胎盤和乳腺細(xì)胞可通過改變銅水平以及激素調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)ATP7A蛋白的表達(dá)[22-23]。在乳腺組織中，上皮細(xì)胞頂端質(zhì)膜區(qū)的ATP7B轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在催乳激素誘導(dǎo)下，將銅跨越上皮組織屏障，排入到乳液中[24]。此外，現(xiàn)已證實位于基底外側(cè)膜的由催乳素誘導(dǎo)的APT7A和CTR1與乳液中銅增加有關(guān)。在胎盤組織中，通過胰島素和雌激素的調(diào)節(jié)下，ATP7A及ATP7B在特定位轉(zhuǎn)錄被激活，ATP7B攜銅位于上皮細(xì)胞的高爾基體，然而ATP7A則將銅轉(zhuǎn)出到基底側(cè)膜[25]。

以上的研究表明腎臟中銅吸收可能是通過不同器官間的激素調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用的結(jié)果。與上述推測類似的是關(guān)于肝臟激素之一的鐵調(diào)素，參與腎臟鐵吸收的，一并起到關(guān)鍵作用。未來可對腎臟中相關(guān)激素或類激素的銅穩(wěn)態(tài)調(diào)控機(jī)制進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

大量研究已經(jīng)明確了調(diào)節(jié)腎臟細(xì)胞銅穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。腎臟銅穩(wěn)態(tài)是由多種銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、含銅酶及細(xì)胞內(nèi)外銅水平的動態(tài)調(diào)控的結(jié)果。目前，對于腎臟細(xì)胞的幾種主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)途徑已經(jīng)充分認(rèn)識，但在銅伴侶蛋白的干涉、啟動子的誘導(dǎo)以及激素調(diào)節(jié)在腎臟細(xì)胞銅平衡調(diào)控上有待進(jìn)一步深入研究。

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