Box-Behnken法優(yōu)化超聲輔助酶法提取靈芝多糖的工藝研究

鄭丹婷 苑子涵 崔佳燕 蔡思敏 韓 偉

（華東理工大學(xué)中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237）

0 引言

靈芝（Ganoderma Lucidum Karst），又稱“林中靈”，是孔菌科真菌靈芝的子實體[1]。2015年版《中國藥典》收錄有赤芝與紫芝兩個品種。作為具有數(shù)千年藥用歷史的中國傳統(tǒng)藥材，靈芝具有很高的藥用價值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實，其具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、保肝、提高耐缺氧能力等功效[2]。

靈芝多糖（Ganoderma Lucidum Polysaccharide）是多孔菌科靈芝屬真菌菌絲體的次生代謝產(chǎn)物，存在于靈芝屬真菌的菌絲體和子實體中，具有清除體內(nèi)自由基、提高機體免疫力、降血糖[3]等功效，被認(rèn)為是靈芝扶正固本的根本[4]。

靈芝多糖存在于靈芝子實體的細胞壁內(nèi)壁，而子實體結(jié)構(gòu)致密，在提取過程中的傳質(zhì)阻力比較大，且靈芝多糖的相對分子量很大，傳統(tǒng)的提取方法主要依靠的是擴散原理[5]，因此提取效率較低。超聲提取法是一種利用超聲波的空化作用、機械作用和熱效應(yīng)等加速細胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴散和溶解，以此顯著提高提取效率的提取方法[6]。酶法提取是一種利用酶解作用，破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，以強化胞內(nèi)有效成分?jǐn)U散至胞外的傳質(zhì)過程，從而能夠最大限度地提高中藥有效成分得率的方法。

本文以總多糖得率為指標(biāo)，采用超聲輔助纖維素酶法提取靈芝中的多糖類化合物，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合法（以下簡稱Box-Behnken法）對提取工藝進行優(yōu)化，以期為靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實體，購于上海雷允上藥店；纖維素酶（活性≥400 U/mg），上海瑞永生物科技有限公司；濃硫酸、苯酚、葡萄糖（均為分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗所用儀器設(shè)備如表1所示。

1.3 試驗方法

1.3.1 總多糖的測定

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制：精密稱取已干燥至恒重的無水葡萄糖20 mg，置100 mL容量瓶中，加去離子水至刻度，搖勻溶解，即得0.2 g/L的葡萄糖溶液。

表1 儀器設(shè)備一覽表

（2）最大吸收波長的測定：精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸溶液，放置10 min，于40℃水浴中保溫30 min，取出，放至室溫，加去離子水定容至10 mL，搖勻，室溫下按照紫外-可見分光光度法在400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在490 nm處有最大吸收峰，故選擇490 nm作為本試驗的檢測波長。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加1 mL 5%的苯酚溶液，搖勻后迅速加入5 mL濃硫酸溶液，放置10 min，于40℃水浴中保溫30 min，取出，放至室溫，加去離子水定容至10 mL，搖勻，以第一份溶液為空白溶液，按紫外-可見分光光度法，在490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：A=4.209 6C-0.002 3，R2=0.993 2。

1.3.2 總多糖的單因素提取試驗

將靈芝的子實體干燥至恒重，用粉碎機粉碎，裝袋于陰涼處備用。精確稱取靈芝子實體粉末2 g于圓底燒瓶中，按料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40加入去離子水?dāng)嚢杈鶆?，在一定溫度?5℃、35℃、45℃、55℃和60℃）下超聲提取一段時間（15 min、20 min、25 min、30 min和35 min）后，加入40 mg纖維素酶，在一定溫度下（25℃、35℃、45℃、55℃和65℃）水浴保溫一定時間（30 min、40 min、50 min、60 min和70 min）后，迅速升溫至90 ℃，滅活10 min，自然冷卻后，抽濾，得到靈芝多糖提取液。用去離子水于容量瓶中將提取液定容至100 mL，搖勻后精密吸取稀釋液1 mL，置于10 mL容量瓶中，在490 nm波長處測定吸光度A。

1.3.3 總多糖得率的測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，按以下公式計算總多糖的得率：

式中A——吸光度；

V——提取液總體積，mL；

n——總稀釋倍數(shù)；

m——靈芝子實體粉末的質(zhì)量，g。

1.3.4 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇對多糖得率影響較大的因素，采用四因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計方法（簡稱BBD），以料液比（X1）、超聲時間（X2）、酶解時間（X3）和酶解溫度（X4）為變量，每個變量分別以-1、0、+1表示，設(shè)計29個試驗點的三次回歸組合試驗，確定提取的最佳工藝條件，Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計如表2所示。25 min、30 min和35 min時的靈芝多糖得率，結(jié)果如

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝總多糖提取的單因素試驗

2.1.1 料液比

料液比是影響中草藥中有效成分得率的主要因素之一，在其他條件固定的情況下，分別考察料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40時的靈芝多糖提取得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 料液比對多糖得率的影響

由圖1可以看出，當(dāng)料液比低于1∶30時，隨著料液比的增大，多糖得率大幅度提高；當(dāng)料液比高于1∶30后，隨著料液比的增大，多糖得率增加緩慢；當(dāng)料液比大于1∶35后，多糖得率反而降低。這可能是由于溶劑過多，對后續(xù)的過濾、轉(zhuǎn)移等操作要求過高，造成了一定的損失。因此，本試驗選擇1∶35為最佳料液比。

2.1.2 超聲提取時間

固定靈芝子實體粉末用量、料液比、超聲溫度等條件，分別考察超聲提取時間為15 min、20 min、圖2所示。

圖2 超聲提取時間對多糖得率的影響

由圖2可以看出，多糖得率隨超聲時間的增加而不斷增大，在25 min時達到最高值，這是由于隨著超聲時間的不斷增加，細胞壁的破碎程度不斷增大，細胞內(nèi)的多糖類物質(zhì)更容易向外擴散，充分溶解到周圍的溶劑中去；25 min后，隨著超聲時間的增加，多糖得率反而下降，可能是由于在長時間的超聲波機械作用下，多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致部分多糖降解，致使得率降低[7]。因此，本試驗確定最佳超聲時間為25 min。

2.1.3 超聲提取溫度

固定料液比和超聲提取時間等試驗條件，考察超聲提取溫度為25℃、35℃、45℃、55℃和60℃時的靈芝多糖得率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，當(dāng)超聲提取溫度小于55℃時，多糖得率隨超聲提取溫度升高而增大，至55℃時得率達到最大值。當(dāng)超聲提取溫度大于55℃時，多糖得率隨溫度的升高反而降低，可能是由于溫度的升高導(dǎo)致多糖降解。因此，本試驗確定超聲提取溫度控制在55℃為宜。

圖3 超聲提取溫度對多糖得率的影響

2.1.4 酶解溫度

稱取靈芝子實體粉末2.0 g，在已確定料液比1∶35、超聲提取時間25 min以及超聲溫度55℃的條件下，固定酶解時間為30 min，考察酶解溫度為25℃、35℃、45℃、55℃和65℃時的靈芝多糖得率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解溫度對多糖得率的影響

從圖4可以看出，隨著酶解溫度的升高，多糖得率不斷增大，至55℃達到最大值；55℃后，多糖得率隨著溫度的升高反而降低，可能是因為隨著溫度的不斷升高，酶的反應(yīng)速率不斷增加，但溫度過高和過低都會對酶的活性造成影響。因此，本試驗確定55℃為最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時間

稱取2.0 g靈芝子實體粉末，按料液比1∶35加入去離子水70 mL，于55℃條件下超聲提取25 min后，加入40 mg纖維素酶，控制酶解溫度為55℃，考察酶解時間為30～70 min時的靈芝多糖得率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 酶解時間對多糖得率的影響

從圖5可以看出，多糖得率隨酶解時間的增加而不斷增大，60 min時達到最大值，之后隨著酶解時間的增加，得率不斷降低，可能是由于酶解時間過短，酶促反應(yīng)不完全，而酶解時間過長會導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，得率反而降低[8]。因此，本試驗確定最佳的酶解時間為60 min。

2.2 單因素試驗的方差分析

由2.1可知，每個因素對多糖得率均有影響，且影響程度各不相同。為減少BBD優(yōu)化試驗的試驗次數(shù)，降低操作難度，提高優(yōu)化效率，現(xiàn)對單因素試驗的試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

一般而言，方差數(shù)值越低，表明對應(yīng)的試驗結(jié)果波動越小，即該因素對試驗結(jié)果的影響就越不明顯[9]。由表3可知，各因素對總多糖得率影響程度的大小依次為：酶解時間＞料液比＞酶解溫度＞超聲提取時間＞超聲提取溫度。故在后續(xù)的BBD法優(yōu)化試驗中，選擇酶解時間、料液比、酶解溫度和超聲提取時間這四個因素進行優(yōu)化。

2.3 Box-Behnken法設(shè)計優(yōu)化試驗

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素，即料液比、超聲時間、酶解時間及酶解溫度為自變量，靈芝總多糖得率為因變量，BBD優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果如表4所示。

表3 單因素試驗的方差分析

分析表4中的各變量對靈芝總多糖得率的影響效果，通過多元回歸擬合，可獲得多糖得率與自變量料液比、超聲時間、酶解時間、酶解溫度的編碼回歸方程：Y=6.06+0.059X1-0.033X2+0.13X3+0.19X4+0.11X1X2+0.58X1X3+0.21X1X4+0.34X2X3+0.28X2X4+1.91X3X4+0.12X12+0.63X22-1.34X32-0.18X42-0.77X12X3-0.59X12X4。

表4 BBD優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

回歸模型的方差分析如表5所示。

從表5可以看出，回歸模型極顯著（P＜0.01），而誤差項結(jié)果不顯著，說明回歸方程與實際情況擬合良好，可用此模型對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。顯著性檢驗表明，各因素對響應(yīng)值的影響由強到弱依次為：酶解時間（X4）、酶解溫度（X3）、料液比（X1）和超聲提取時間（X2）?；貧w模型的可信度分析如表6所示，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.916 2（＞0.80），說明預(yù)測值與實測值之間具有高度的相關(guān)性，即該模型可以解釋0.916 2的響應(yīng)值的變化[10]。

2.3.2 Box-Behnken法組合優(yōu)化結(jié)果

在各試驗因素的取值范圍內(nèi)，利用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件預(yù)測最優(yōu)的靈芝多糖提取條件為：超聲提取時間27.82 min、料液比1∶36.22、酶解時間68.24 min、酶解溫度64.13℃。為便于實際操作，最優(yōu)的提取條件修正為：超聲提取時間28 min、料液比1∶36、酶解時間68 min、酶解溫度64℃。在最優(yōu)提取條件下，靈芝多糖的理論得率為7.34%。依據(jù)調(diào)整后的提取條件進行操作，重復(fù)3次，得到的靈芝多糖得率為7.57%，實際測定值與理論值相接近，說明該擬合模型與實際情況擬合良好。

表5 回歸模型的方差分析

表6 回歸模型的可信度分析

3 結(jié)語

（1）采用超聲輔助酶法提取靈芝多糖，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對靈芝多糖得率影響較大的四個因素（料液比、超聲提取時間、酶解溫度和酶解時間），用Box-Behnken法對試驗條件進行優(yōu)化，得到擬合方程為：Y=6.06+0.059X1-0.033X2+0.13X3+0.19X4+0.11X1X2+0.58X1X3+0.21X1X4+0.34X2X3+0.28X2X4+1.91X3X4+0.12X12+0.63X22-1.34X32-0.18X42-0.77X12X3-0.59X12X4，回歸方程與實際情況擬合良好。

（2）超聲輔助酶法提取靈芝多糖的最優(yōu)工藝條件為：超聲提取時間28 min、料液比1∶36、酶解時間68 min、酶解溫度64℃，靈芝多糖理論得率為7.34%，依據(jù)最優(yōu)化提取條件重復(fù)提取3次，靈芝多糖的實際得率為7.57%，實際值與理論值擬合良好，且提取工藝簡便，條件溫和，提取過程安全無污染，與傳統(tǒng)的提取方法相比，該方法提取時間短，得率高，可以用于靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。

［參考文獻］

[1]弓曉峰.黑靈芝元素形態(tài)、活性成分及其保健功能研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2006.

[2]陳偉，馬飛，張琳，等.靈芝有效成分提取及藥理活性研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：147-149.

[3]王波.靈芝多糖提取、分離純化、表征及體外抗氧化活性探究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2016.

[4]YANG Z,CHEN C,ZHAO J,et al.Hypoglycemic mechanism of a novel proteoglycan,extracted from Ganoderma lucidum in hepatocytes[J].European Journal of Pharmacology, 2017,820:77-85.

[5]楊俊紅，郭錦棠，朱養(yǎng)妮，等.中草藥的不同提取方法與強化傳質(zhì)機理研究[J].化工進展，2002，21（9）：660-662.

[6]袁麗娜，金晟君.黃酮類化合物的提取分離純化研究進展[J].黑龍江科技信息，2013，21（4）：55.

[7]吳先輝.苦瓜多糖超聲波提取工藝的研究[J].長江蔬菜，2009（24）：42-44.

[8]劉成程.高吸水性玉米多孔淀粉的制備及其生物相容性和止血效果的研究[D].西安：西北大學(xué)，2010.

[9]施昶，黃海飛，李夢園，等.微波提取山楂中黃酮類化合物的工藝優(yōu)化[J].生物加工過程，2017，15（1）：43-48.

[10]羅文鋒，韓偉.Box-Behnken試驗設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化金針菇多糖的工藝[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，38（4）：95-100.